1. Traitement PKI
REMARQUE : Ceci est facultatif, mais recommandé pour les tétramères Mamu-B*017:01.
- Remettre en suspension le PBMC dans un milieu R10 à une concentration de 1,6 x 107 cellules/ml.
- Ajoutez 50 μl de cette suspension cellulaire dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. Ajouter 50 μl d’une solution de 100 nM de PKI dans chaque tube.
- Vortex chaque tube. Incuber à 37 °C pendant 30 min. À la fin de cette étape, chaque tube doit contenir 100 μl d’une suspension cellulaire contenant 8,0 x 105 PBMC et 50 nM de PKI.
- Passez à l’étape de coloration du tétramère pMHC-I.
2. Coloration avec des tétramères pMHC-I marqués au fluorochrome
- Avant de préparer le mélange maître de tétramères pMHC-I, centrifugez les tubes tétramères pMHC-I à 20 000 x g pendant au moins 15 min à 4 °C. L’objectif de cette étape est de granuler les agrégats de protéines dans la solution de tétramère pMHC-I qui peuvent augmenter la coloration de fond. Une fois l’étape de centrifugation effectuée, évitez de pipeter depuis le bas du tube où les agrégats de protéines se seront accumulés.
- Préparez suffisamment de mélange maître de tétramères pMHC-I pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparez un excédent de 15 % du volume total de ce mélange maître pour tenir compte des erreurs de pipetage.
- Diluer les tétramères pMHC-I dans un tampon de coloration (p. ex., tampon de coloration brillant) de sorte que 25 μl du mélange maître de tétramères pMHC-I soient ajoutés à chaque essai.
- Étiqueter le PBMC à l’aide de deux tétramères pMHC-I par test, l’un conjugué à l’allophycocyanine (APC) et l’autre au violet brillant (BV) 421.
- Ajouter 8,0 x 105 PBMC dans les tubes de cytométrie en flux correspondants dans un volume final de 100 μl. Si les cellules ont été soumises au traitement PKI décrit ci-dessus, elles doivent déjà être remises en suspension dans 100 μl à cette étape.
- Ajouter 25 μl de mélange maître de tétramères pMHC-I dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. À la fin de cette étape, le volume final de chaque tube doit être de 125 μl.
- Vortex chaque tube afin d’homogénéiser la suspension cellulaire.
- Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 45 min. Préparez le cocktail d’anticorps monoclonaux (mAb) de coloration de surface pendant cette incubation de 45 minutes.
3. Coloration de surface
- Préparez suffisamment de mélange maître d’AcB pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparez un excédent de 15 % du volume total de ce mélange maître pour tenir compte des erreurs de pipetage.
- Ajustez le volume du mélange principal avec un tampon de coloration de manière à ce que 50 μl soient ajoutés par test.
- Pour l’exclusion correcte des lymphocytes T non CD8+ et la délimitation des sous-ensembles de mémoire, utilisez des quantités titrées d’AcM dirigées contre les molécules suivantes dans le mélange maître de coloration de surface.
note: Les fluorochromes conjugués à chaque anticorps monoclonaux sont fournis à titre de référence : CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 et CCR7 FITC. Notez que les anticorps monoclonaux contre CD14, CD16 et CD20 sont conjugués au même fluorochrome (c’est-à-dire BV 510) puisqu’ils seront inclus dans la porte de « décharge ».
- Inclure un colorant fixable pour discriminer les cellules mortes dans le mélange maître de coloration de surface [c’est-à-dire un colorant réactif aux amines (ARD)]. Assurez-vous que le réactif ARD est conjugué à un fluorochrome ayant un spectre d’émission similaire à ceux utilisés dans la porte de décharge. Dans ce cas, utilisez ARD Aqua.
- Ajouter 50 μl du mélange maître de coloration décrit aux points 3.1 à 3.4 dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. À la fin de cette étape, le volume final dans chaque tube doit être de 175 μl.
- Vortex chaque tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 25 min.
- Cellules de lavage avec tampon de lavage (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,45 g/L de NaN3).
prudence: L’azoture de sodium (NaN3) est une substance toxique. L’exposition à des quantités même infimes peut provoquer des symptômes. Manipulez cette substance conformément aux lignes directrices précisées par le Bureau de l’environnement, de la santé et de la sécurité (SSE) de l’établissement où ces expériences sont effectuées.
- Tubes à centrifuger à 510 x g pendant 5 min. Décanter soigneusement le surnageant dans un conteneur à déchets séparé. Assurez-vous de ne pas déranger le pellet.
prudence: Ne décantez pas le surnageant du tampon de lavage dans des réservoirs contenant de l’eau de Javel, car il peut réagir avec l’azoture de sodium présent dans le tampon de lavage et entraîner la formation d’un gaz toxique. Communiquez avec le bureau de l’EHS de l’établissement où ces expériences sont menées pour obtenir des directives sur la façon d’éliminer l’azoture de sodium.
- Après la décantation, vortex les cellules dans le liquide restant retenu dans chaque tube.
4. Fixation cellulaire
- Ajouter 250 μl d’une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % dans tous les tubes pour fixer les cellules.
ATTENTION : Le PFA est une substance toxique. L’exposition à des quantités même infimes peut provoquer des symptômes. Manipulez cette substance conformément aux lignes directrices spécifiées par le bureau EHS de l’établissement où ces expériences sont effectuées.
- Étant donné que la solution de PFA à 2 % doit être isotonique aux cellules, utilisez du PBS pour préparer cette solution. Cent millilitres d’une solution de PFA à 2 % suffisent pour plusieurs expériences. Vortex soigneusement tous les tubes immédiatement après l’ajout de 2 % de PFA afin d’éviter la formation d’agrégats cellulaires.
- Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min.
- Lavez les cellules en répétant les étapes 3.7-3.9. Une fois cette étape terminée, les cellules peuvent être stockées dans l’obscurité à 4 °C pendant 24 à 48 heures. Avant de passer à la phase de perméabilisation, faites un tour complet des tubes.
5. Perméabilisation des cellules
- Ajouter 500 μl de tampon de perméabilisation. Vortex tous les tubes.
- Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.
- Lavez les cellules en répétant les étapes 3.7-3.9.
6. Coloration intracellulaire
- Préparez suffisamment de mélange maître d’AcB pour colorer tous les tubes expérimentaux.
- Ajustez le volume avec du PBS ou un tampon de coloration de manière à ce que 50 μl du mélange maître d’AcM intracellulaire soient ajoutés par test.
- Préparer le mélange maître d’AcM décrit aux sections 6.1 et 6.2 en utilisant des quantités titrées d’AcM dirigées contre CD3 et le granzyme B (Gzm B).
note: L’engagement du TCR par les tétramères pMHC-I peut entraîner l’internalisation de CD3, ce qui peut interférer avec la détection des lymphocytes T tétramères + CD3+ CD8+ si le mAb anti-CD3 est ajouté au mélange maître de coloration de surface. Pour éviter cela, ajoutez l’anticorps monographique anti-CD3 à ce stade, c’est-à-dire après la perméabilisation des cellules. Les fluorochromes conjugués à chaque mAb sont répertoriés comme référence : CD3 PerCP Cy5.5 et Gzm B PE.
- Ajouter 50 μl de cocktail d’anticorps monoclonaux dans les tubes correspondants. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
- Lavez les cellules en répétant les étapes 3.7-3.9. Les tubes sont prêts à être acquis dans un cytomètre en flux.