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1. Marquage fluorescent et perfusion de leucocytes (PMN ou THP-1 pour l’homme et RAW264.7 ou monocytes primaires de souris pour le dosage en flux murin)
- Marquage fluorescent
- Étiquetez les leucocytes (1 x 106/mL) avec la coloration verte à l’acide nucléique fluorescent perméable à la cellule (1 μM). Incuber les cellules pendant 30 min à 37 °C.
- Laver les cellules avec du PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et suspendre les cellules à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL (5 mL par condition d’essai, en fonction du débit) dans le tampon de dosage.
- Préparation du test en chambre d’écoulement
- Pour l’adhésion des leucocytes sur une monocouche cellulaire, jetez le milieu de culture cellulaire de la boîte et assemblez-le dans la chambre d’écoulement. Connectez le tube à la seringue. Pour l’adhésion leucocytaire sur les plaquettes immobilisées, connectez la micro-lame à la seringue. Préchauffez un bain-marie à 37 °C.
- Prenez une seringue de perfusion (50 ml), installez la seringue sur le porte-seringue et réglez la pompe en mode de retrait. Réglez le volume de la pompe sur 0 ml et réglez le diamètre sur 26,70 mm pour la seringue de 50 ml.
- Connectez un connecteur Luer coudé à une extrémité du tube. Placez un coupleur Luer Lock sur la seringue et connectez le tube avec le connecteur Luer coudé au coupleur Luer Lock. Connectez l’extrémité libre du tube à la chambre d’écoulement.
- Perfusion et adhésion des leucocytes
- Pour l’adhésion des leucocytes sur une monocouche cellulaire, jetez le milieu de culture cellulaire de la boîte et assemblez-le dans la chambre d’écoulement. Connectez le tube à la seringue. Pour l’adhésion leucocytaire sur les plaquettes immobilisées, connectez la micro-lame à la seringue.
- Pour la perfusion et l’adhésion des leucocytes sur une monocouche vasculaire ou plaquettaire, placez le deuxième tube dans un tube conique de 50 ml contenant un tampon de dosage et remplissez le tube avec une pipette de 1 ml, puis pressez le tube et connectez-le à une chambre d’écoulement.
- Avant la perfusion leucocytaire, ajouter 3 mM de CaCl2 et 2 mM de MgCl2 à la suspension cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 °C.
- Tampon de dosage de perfusion avant la perfusion des cellules pour éliminer l’air possible de la chambre et de la tubulure.
- Fermez les extrémités des tubes en les serrant fermement et en faisant passer le tube du tampon de dosage à la suspension cellulaire, empêchant ainsi les bulles d’air d’être piégées. Perfuser les cellules avec un débit/contrainte de cisaillement approprié jusqu’à l’arrivée des premières cellules.
- Perfuser les cellules avec un débit/contrainte de cisaillement approprié pendant 2 min, et capturer au moins 6 images entre 2 et 6 min de cellules roulantes et adhérentes avec un microscope à contraste de phase/fluorescence inversé (par exemple, EVOS-FL) en utilisant un grossissement de 100X connecté à une caméra numérique CCD ou CMOS.
REMARQUE : La contrainte d’écoulement/cisaillement dépend des dimensions de la chambre d’écoulement et de la viscosité du perfusat. Pour la chambre de perfusion utilisée ici (voir la table des matériaux) :
τ=η*97.1*Φ
τ : contrainte de cisaillement (1 dyn/cm2)
η : viscosité (0,015 dyn*s/cm2)
Φ : Débit (0,67 mL/min)
- Dé-adhérence des leucocytes
- Pour la désadhérence, passez de la suspension cellulaire au tampon de test en pressant le tube, empêchant ainsi les bulles d’air de se coincer.
- Détacher les cellules par perfusion avec un tampon de dosage avec un débit et une contrainte de cisaillement appropriés (voir 3.3.7 Note).
- Transmigration leucocytaire
- Pour la transmigration leucocytaire, perfuser les leucocytes (étape 3) jusqu’à ce qu’une quantité adéquate de leucocytes adhère (~50 cellules/champ de vue).
- Remplacer la suspension leucocytaire par un tampon de dosage.
- Enregistrez les cellules en transmigration par time-lapse toutes les 10 à 15 s pendant 30 à 60 min à 37 °C.