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1. Fabrication de nanostructures
- Choisissez des lamelles en verre de 25 mm de diamètre et d’une épaisseur approximative de 170 μm (n° 1,5) comme substrats pour la nanofabrication.
- Immergez les lamelles dans une solution de piranha (rapport 3:1 d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène) pendant au moins 6 h. Lavez la lamelle imbibée de piranha avec de grandes quantités d’eau distillée désionisée ultrapure de 18,2 MΩ.
prudence: L’acide piranha réagit violemment avec les matières organiques et doit être manipulé avec une extrême prudence.
- Déposez une couche mince de chrome de 10 nm sur les lamelles de recouvrement par évaporation par faisceau d’électrons pour éviter les effets de charge lors de la structuration et de l’imagerie des nanostructures.
- Faites tourner la première couche de résine bicouche composée de copolymère de méthacrylate d’éthyle de méthyle (MMA_EL6) à 2 000 tr/min pendant 45 secondes, puis faites cuire à 150 °C. Faites tourner la deuxième couche de polyméthacrylate de méthyle (950PMMA_A2) à 3 000 tr/min pendant 45 secondes, puis faites cuire à 180 °C.
- Modélisez la résine bicouche à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons (EBL) à 25 kV avec une dose de surface de 300 μC/cm2. Développer dans de l’alcool isopropylique (IPA)/méthylisobutylcétone (MIBK) : 2/1 et rincer dans de l’IPA.
- Déposez un film Ti (5 nm) / Au (80 nm) sur le substrat à l’aide d’un évaporateur à faisceau d’électrons.
- Après le dépôt d’or, retirez la résine bicouche du copolymère en trempant le substrat dans de l’acétone pendant 4 heures.
- Inspectez le substrat à l’aide du microscope électronique à balayage (MEB) pour confirmer la forme et la taille de la nanostructure, retirez le chrome restant du substrat par gravure humide à l’aide de l’agent de gravure CR-7 pendant 60 secondes à RT, puis rincez à l’aide d’un DDW.
- Concevez un espacement de 33 μm de centre à centre pour laisser de la place pour l’imagerie cellulaire entre les réseaux. Modélisez les nanostructures selon un motif de 20 x 20 pour chaque réseau avec un pas de 300 nm à l’aide d’un graveur à faisceau d’électrons. Chaque puce contient 300 réseaux avec une dimension de nanostructure typique de 80±2,5 nm de hauteur et 70±2,5 nm de diamètre.
- Inspectez un sous-ensemble de réseaux à l’aide du microscope à force atomique (AFM) pour vérifier la taille et l’uniformité.
- Fixez un anneau de support, généralement du silicium, à l’arrière de la lamelle à l’aide d’un époxy durcissant aux UV.
2. Nettoyage des copeaux et application d’une monocouche auto-assemblée
- Pour le nettoyage et la régénération des copeaux, cendres plasma à une puissance de 40 W dans un mélange de 300 mTorr de 5 % d’hydrogène et de 95 % d’argon pendant 45 sec après avoir nettoyé la chambre pendant 5 min dans les mêmes conditions.
- Fonctionnaliser les nanostructures d’or immédiatement après l’incinération au plasma en immergeant la puce dans une solution de thiol éthanolique à deux composants composée d’un rapport 3:1 de SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) et d’un composant ayant un groupe fonctionnel amine ou carboxyle, à savoir SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) ou SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Laissez la puce dans la solution de thiol O/N pour former une monocouche auto-assemblée (SAM).
- Rincez la puce à l’éthanol et séchez-la avec de l’azote gazeux.
- Si nécessaire, conservez la puce fonctionnalisée jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
- Lorsqu’il est prêt à l’emploi, réagissez le composant SPN ou SPC avec le ligand à l’aide d’une chimie dépendant du ligand choisi (voir ci-dessous).
note: Les puces peuvent être régénérées et refonctionnalisées des dizaines de fois. Une puce donnée peut être utilisée pour des périodes allant de 6 mois à plus d’un an. Les spectres mesurés sur un réseau donné sont reproduits de manière fiable après des régénérations répétées par assèchement au plasma, suivies d’une biofonctionnalisation.
3. Fonctionnalisation de surface et caractérisation cinétique
Remarque : Utilisez la puce fonctionnalisée de l’instrument SPR commercial pour caractériser les constantes de vitesse cinétique entre le ligand et l’analyte, ainsi que pour étudier la résistance de SAM à la liaison non spécifique. Il existe une large gamme de débits et de conceptions microfluidiques qui permettent une fonctionnalisation efficace de la surface. Comme nous disposons d’un SPR disponible dans le commerce, nous l’avons normalisé en fonction de ses débits recommandés. Nous notons que ces débits sont typiques de tous les instruments SPR et ne sont donc pas restrictifs. L’instrument SPR n’est pas une nécessité puisque toute la fonctionnalisation peut être effectuée directement sur la puce d’imagerie par résonance plasmonique de surface localisée (LSPR), mais il a réduit notre charge de travail car il s’agit d’un instrument multiplexé alors que notre configuration microfluidique LSPR ne l’est pas.
- Fonctionnaliser une puce commerciale en or nu avec le SAM comme décrit à la section 2.
- Si vous utilisez un SAM à base de SPC, activez le groupe carboxyle avec un mélange 1:1 de 133 mM de 1-éthyl-3-(3-diméthyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) et de 33 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans DDW pendant 10 min.
- Conjuguez le groupe carboxyle activé avec l’anticorps/ligand d’intérêt pendant 300 secondes en utilisant un débit de 30 μl/min. Préparez généralement les ligands dans un tampon phosphate pH 6, mais cela peut varier en fonction de la molécule.
- Après la conjugaison du ligand, faire couler 0,1 M d’éthanolamine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme étape de désactivation pendant 300 secondes à un débit de 30 μl/min. L’éthanolamine aide à minimiser la liaison non spécifique.
- Introduire l’analyte d’intérêt à un débit de 100 μl/min à l’aide d’une gamme de concentrations et calculer les constantes de vitesse cinétique à l’aide d’un logiciel d’analyse cinétique.
- Si la liaison non spécifique pose problème, augmentez le rapport SPO/SPC ou SPN.
4. Paramètres généraux du LSPR
- Réglages du microscope :
- Utilisez une lampe halogène de 100 W pour éclairer l’échantillon. Utilisez un filtre passe-long (généralement une coupure de 593 nm) dans le trajet de la lumière pour éliminer les longueurs d’onde qui ne contribuent pas au décalage de résonance (Figure 1).
- Pour la collecte de données LSPRi, utilisez un microscope inversé avec un objectif à immersion dans l’huile 40X (1,4 NA) et une caméra CCD 16 bits refroidie thermiquement.
- Placez un séparateur de faisceau sur le port de sortie du microscope pour obtenir simultanément des images et des spectres.
- Réglez la platine du microscope à température contrôlée à 37 °C et équilibrez pendant 4 heures.
- Incorporer un ensemble d’incubation supplémentaire sur le microscope pour réguler la concentration deCO2 et l’humidité à 5 % et 95 %, respectivement.
- Préparation et montage des copeaux :
- Fonctionnaliser la puce LSPR comme décrit dans la section 2 avec les rapports SAM optimaux à deux et 8 composants déterminés à partir des expériences SPR.
- Chargez la puce dans un support microfluidique sur mesure comme suit. Placez la puce sur une pièce inférieure en aluminium. Sandwichez la puce entre cette pièce inférieure et un joint en silicone et une pièce supérieure en plastique transparent. Utilisez 4 vis pour serrer l’ensemble.
- Pour une application typique de thiol à base de SPC, appliquer une couche de dépôt de 300 μl sur un mélange 1:1 de 133 mM d’EDC et de 33 mM de NHS dans le DDW pour activer les groupes carboxyles du composant thiol SPC.
- Attendez 10 min et rincez manuellement la surface avec 10 mM de PBS.
- Conjuguer le groupe carboxyle activé avec le ligand (généralement un anticorps ou un fragment d’anticorps) d’intérêt en enrobant 300 μl de solution de ligand.
- Attendez 30 min et rincez manuellement avec 10 mM de PBS.
- Couche de protection de 300 μl d’éthanolamine 0,1 M dans du PBS sur la puce pour minimiser la liaison non spécifique. Attendez 10 min.
- Lavez l’éthanolamine avec du PBS contenant 0,005 % de Tween 20 (PBS-T20).
- Placez un morceau de quartz au-dessus de la puce pour réduire les fluctuations des données liées à un ménisque changeant.
- Gardez la puce humide avec la mémoire tampon PBS-T20 pendant le montage sur le microscope.
- Placez fermement l’ensemble de puce LSPR dans le porte-échantillon de platine chauffé et fixez le tube microfluidique.
- Fixez la tubulure microfluidique à l’ensemble et au tampon d’écoulement (ou au milieu sans sérum pour les études cellulaires) jusqu’à ce qu’un état stable soit atteint.
- Laissez l’ensemble et le microscope s’équilibrer pendant au moins 2 heures.
- Alignez la puce à l’aide d’un joystick de sorte que le réseau central soit aligné avec la fibre optique pour la spectroscopie. Les données spectroscopiques sont prises à l’aide d’un spectromètre et d’un logiciel d’analyse spectrale.
- Gardez les réseaux au point tout au long de l’expérience en utilisant l’autofocus logiciel, Zeiss Definite Focus ou un appareil de mise au point automatique équivalent.
5. Imagerie LSPR des sécrétions anti-c-myc à partir de cellules d’hybridome 9E10
Remarque : La lignée cellulaire d’hybridome utilisée pour cette étude exprime l’anticorps anti-c-myc de manière constitutive et ne nécessite donc pas de déclencheur chimique
- Fonctionnaliser les nanostructures avec le peptide c-myc. Celui-ci a une valeur KD de 1,77 nM pour les anticorps anti-c-myc sécrétés par les cellules d’hybridome clone 9E10.
- Cultivez les cellules d’hybridome dans un milieu de croissance complet avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotique dans une fiole T75 à 37 °C sous 5 % de CO2. Maintenir une densité cellulaire de 4 ×105 cellules/ml.
- Pour les études de sécrétion cellulaire, les cellules granulaires du ballon T75 par centrifugation, sont lavées deux fois avec un milieu sans sérum (SFM) RPMI-1640 pour éliminer les anticorps sécrétés et ajuster la densité cellulaire à 4 ×106 cellules/ml.
- Récoltez les cellules et testez leur viabilité avant de les introduire dans les puces LSPR.
- Introduisez manuellement 50 μl de la solution cellulaire dans les puces LSPR à l’aide d’une micropipette. Au bout de quelques minutes, 25 à 50 cellules adhèrent à la surface des puces LSPR.
- Laver les cellules restantes en solution avec du SFM frais à l’aide du système de perfusion microfluidique.
- Sélectionnez les réseaux LSPR pour l’imagerie qui sont proches, à moins de 10 μm, mais qui ne chevauchent pas les cellules.
- Pour s’assurer que le signal est spécifique aux anticorps anti-c-myc sécrétés, introduisez les milieux de culture cellulaire avec et sans les anticorps présents, ainsi qu’avec les anticorps mais avec leurs sites de liaison bloqués par la présence d’une concentration saturante de peptide c-myc dans la solution.
- Calibrer les capteurs à la fin de chaque cycle avec une solution saturante d’anticorps anti-c-myc (250 nM). Cela permet de normaliser la réponse des capteurs et de déterminer l’occupation fractionnée en fonction du profil de biofonctionnalisation de chaque exécution.
- Corrigez la dérive dans les directions X et Y à l’aide d’un logiciel d’alignement d’image.
