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1. Titrage du virus
REMARQUE : En fonction du nombre de virus et du nombre de doublons, une plaque de puits peut être mise en place avec les flexibilités suivantes : (1) La dilution virale peut être disposée le long des lignes ou des colonnes (Figure 1). Chaque virus doit occuper une ligne/colonne distincte. (2) L’augmentation de dilution virale est flexible, mais elle doit commencer par la concentration virale la plus élevée dans le coin supérieur gauche. (3) Il n’y a aucune restriction quant au nombre de doublons.
- Aliquote suffisamment de cellules MDCK ou de cellules MDCK-SIAT8 dans des plaques de 96 puits (200 μl/puits). Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 ou 3 jours jusqu’à la confluence. Propager les cellules dans du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (SCF) et des antibiotiques (100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine). Incuber les cellules SIAT à 37 °C avec 5 % de CO2 et 1 mg/ml de sulfate G418.
note: Le facteur de dilution dépend de l’expérience et de la lignée cellulaire utilisée. La monocouche cellulaire doit être confluente (c’est-à-dire qu’il n’y a pas de paroi cellulaire ni de contour visible pour les cellules MDCK et une disposition serrée pour les cellules MDCK-SIAT1) au moment de l’inoculation du virus. Des exemples de dilutions basées sur la sous-culture de flacons confluents de cellules MDCK ou MDCK-SIAT1 sont donnés dans le Tableau 1.
- Laver les cellules 3 fois avec 200 μl de milieu de croissance virale (VGM) par puits. Stérilisez le laveur de plaques à parois multiples avec 70 % d’EtOH pendant 30 min, puis rincez-le dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) ou VGM avant le lavage.
- Aspirez le VGM et ajoutez immédiatement 50 μl de VGM dans chaque puits.
- Ajoutez 900 μl de VGM dans chacun des 6 tubes stériles (ou moins, selon le nombre de virus testés et de doublons). Pipeter 100 μl de virus dans le premier tube, bien mélanger et diluer en série, en changeant les pointes entre chaque dilution. Répétez l’opération pour chaque virus à titrer.
note: Cela donnera des dilutions virales de 10-1 à 10-6.
- Ajouter 50 μl de chaque dilution virale, en commençant par la dilution la plus élevée (1 x 10-5 sur la figure 1), dans des puits dupliqués (colonnes 9 et 10 de la figure 1) d’une plaque de 96 puits.
- Placez la plaque à 37 °C pendant 2-3 heures pour permettre au virus d’infecter les cellules.
note: Une incubation de 2 à 3 heures est nécessaire pour s’assurer que les virus de l’inoculum ont suffisamment de temps pour atteindre la monocouche.
- Préparez le recouvrement (10 ml/plaque)
note: Le recouvrement se compose de 5 ml de DMEM 2x, de trypsine (concentration finale de 2 μg/ml), de 20 μl de stock de 1 mg/ml et de 5 ml de linters de coton cellulosique (voir la liste des matériaux).
- Retirez l’inoculum.
- Ajouter le recouvrement (200 μl dans chaque puits). Incuber toute la nuit à 37 °C, sans être dérangé.
note: Le bourgeonnement du virus a lieu après environ 4 heures, il est donc important que la plaque ne soit pas perturbée après cette période.
- Aspirez le revêtement des puits.
- Ajouter du paraformaldéhyde glacé à 4 % dans du PBS A (200 μl/puits). Placez-les à 4 °C pendant 30 min ou à température ambiante pendant 20 min.
REMARQUE : Le PBS A est une solution saline tamponnée au phosphate au pH naturel avec 10 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na2HPO4, 0,25 g de KH2PO4 et 1 L d’eau distillée (voir la liste des matériaux).
REMARQUE : Le paraformaldéhyde est nocif lorsqu’il est inhalé et peut provoquer des brûlures en cas d’ingestion. Il existe également des preuves limitées d’un effet cancérigène, et il peut provoquer une sensibilisation après un contact avec la peau.
- Aspirez le paraformaldéhyde et lavez les plaques deux fois avec du PBS A (200 μl/puits).
- Conservez les plaques dans le PBS A à 4 °C pour une utilisation future, ou poursuivez les étapes suivantes.
- Ajouter un tampon de perméabilisation (100 μl/puits). Laissez-le à température ambiante pendant 30 min.
- Lavez la plaque deux fois avec du PBS A (200 μl/puits).
- Ajouter 50 μl du premier anticorps, l’anticorps monoincident de souris contre la grippe de type A (1:1 000 dans le tampon ELISA), par puits. Incuber à température ambiante pendant 1 heure (ou 4 °C toute la nuit), en secouant.
- Lavez-le 3 fois dans 100 μl de tampon de lavage (0,05 % Tween 80 dans PBS A, v/v) par puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min entre les lavages. Alternativement, lavez-le 3 fois sans incubation avec 300 μl par puits.
- Ajouter 50 μl du deuxième anticorps, le conjugué HRP anti-souris IgG (H+L) de chèvre (1:1 000 dans le tampon ELISA), par puits. Incuber à température ambiante pendant 1 heure, en secouant.
- Lavez-le 3 fois comme décrit à l’étape 1.17.
- Ajouter le substrat (50 μl/puits). Incuber à température ambiante pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que le développement d’une couleur bleue soit clairement visible.
- Pour arrêter la réaction, lavez la plaque deux fois avec 200 μl d’eau distillée par puits, en l’incubant à température ambiante pendant 2 à 3 minutes entre les lavages.
- Faites sécher l’assiette à l’air libre et rangez-la dans un endroit sombre (par exemple, enveloppez-la dans du papier d’aluminium).
2. Neutralisation du virus
REMARQUE : Calculez le nombre de plaques nécessaires pour le test de neutralisation. Chaque plaque peut accueillir un virus et un certain nombre d’antisérums.
REMARQUE : En fonction du nombre d’antisérums et du nombre de doublons, une plaque à puits peut être mise en place avec les flexibilités suivantes : (1) La dilution sérique peut être disposée le long d’une ligne ou d’une colonne (Figure 2). Chaque sérum doit occuper une ligne ou une colonne distincte. (2) L’augmentation de la dilution sérique est flexible, mais elle doit commencer par la concentration sérique la plus élevée dans le coin supérieur gauche d’une plaque. (3) Le nombre de doublons équilibre le nombre d’antisérums. Plus de doublons peuvent aider à lisser les variations expérimentales. (4) Le nombre de VC et le nombre de doublons de contrôle de cellule (CC) sont flexibles, mais ils doivent également être répartis dans des lignes ou des colonnes distinctes. On s’attend à ce que le nombre de duplicatas de VC soit significativement supérieur à celui des antisérums.
- Préparez la monocouche cellulaire, comme aux étapes 1.1 à 1.3, 2 ou 3 jours à l’avance.
- Ajouter 50 μl de VGM dans chaque puits de la plaque.
- Utilisez les colonnes 11 et 12 pour VC et CC, respectivement. Ajouter 50 μl d’aliquotes de sérum traité par une enzyme destructrice de récepteur (RDE) 1:20 à la première rangée (A) des colonnes 1-10.
note: Pour chaque combinaison de virus et de sérum, le test est effectué en double, de sorte qu’une plaque peut, par exemple, contenir un virus testé contre cinq antisérums.
- Effectuez des dilutions en série 2 fois en transférant 50 μl de la rangée A à la rangée H (colonnes 1 à 10 de la figure 2) et en jetant 50 μl de la rangée H.
- Ajouter 50 μl de diluant dans chaque puits de la colonne CC (colonne 12 de la figure 2).
- Ajouter 50 μl du virus dans chaque puits de la plaque, à l’exception de la colonne CC (colonnes 1 à 11, rangées A à H de la figure 2).
- Incuber à 37 °C pendant 2-3 h. Retirez l’inoculum. Ajoutez le revêtement (200 μl) dans chaque puits. Incuber toute la nuit à 37 °C, sans être dérangé. Fixez et colorez les plaques comme pour le titrage du virus (étapes 1.11-1.22).
3. Quantification de la neutralisation
- Placez une plaque à puits dans la zone de balayage d’un scanner à plat, comme illustré à la Figure 2a. Utilisez la limite de position en forme de L pour garantir un emplacement d’imagerie optimal et reproductible.
note: Il est possible d’imager deux plaques à puits en un seul balayage.
- Scannez la plaque.
- Exécutez le logiciel « Wellplate Reader » pour calculer les titres viraux requis (Figure 3).
- Cliquez sur le bouton « Charger l’image » pour charger une image. Faites glisser la barre rouge dans « Seuil global » pour ajuster le seuil d’échantillonnage. Cliquez sur le bouton « Mettre à jour » pour examiner l’effet.
- Cochez la case « Calculer la neutralisation/titration ». Cliquez sur le bouton « Échantillonnage » pour quantifier l’ICP. Cliquez sur le bouton « Enregistrer » pour enregistrer les résultats de l’échantillonnage lorsque vous y êtes invité.
note: Après le processus d’échantillonnage, une nouvelle fenêtre appelée « Calcul de la neutralisation et du titrage » apparaît automatiquement si la case « Calculer la neutralisation/titrage » est cochée.
- Chargez ou saisissez la carte de la plaque de puits. Indiquez le seuil (p. ex., 50 %) dans « Neutralisation : déduction de l’infection ( %) ».
- Sélectionnez « Processus de neutralisation » pour calculer les titres. Vérifiez les titres et cliquez sur le bouton « Enregistrer et fermer » pour enregistrer les résultats de la neutralisation.
note: La neutralisation est rapportée comme l’inverse de la dilution la plus élevée du sérum avec la réduction prédéfinie de l’ICP (comme 50 % ou 80 %) par rapport à la VC (la moyenne de la colonne 11 de la figure 4). Une réduction de 50 % de la PIC a été utilisée dans les résultats représentatifs.
