Quantification de l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Résumé

Source : Luhr, M. et al., Le test de séquestration de la lactate déshydrogénase - Une méthode simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans les cellules de mammifères. J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo montre un test permettant d’évaluer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Il utilise l’électroporation pour libérer des protéines cytosoliques, y compris la lactate déshydrogénase (LDH). Les fractions de LDH séquestrée et de LDH cellulaire totale sont déterminées pour évaluer la séquestration de la LDH, ce qui donne un aperçu de l’activité globale de séquestration en vrac.

Protocole

1. Ensemencement et traitement des cellules

1. Cultiver des cellules adhérentes dans des flacons de culture tissulaire de 75 cm² dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C, en utilisant le milieu de culture préféré pour le type de cellule en question. Laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent une couche cellulaire presque confluente.
   note: Utilisez le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) pour LNCaP, HEK293, les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les cellules BJ, MCF-7 et RPE-1.
   1. Lavez les cellules avec 3 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C, pH 7,4. Remplacer le PBS par 3 mL de trypsine-éthylènediaminetétraacétate (EDTA) à 0,25 % (p/v) et incuber le ballon dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent (2 à 5 min).
   2. Remettre en suspension les cellules détachées avec un milieu de culture de 7 mL contenant 10 % de FBS. Mélangez une aliquote de suspension cellulaire de 10 μL avec 10 μL de bleu de trypan à 0,4 % dans un tube de microcentrifugation, à l’aide d’une pointe de pipette de 0,5 à 20 μL. Utilisez la même pointe de pipette pour remplir immédiatement une lame de chambre de comptage et comptez les cellules dans un compteur de cellules automatisé.
2. Préparer une dilution appropriée (voir note ci-dessous) de la suspension cellulaire à partir de l’étape 1.1.2 à l’aide d’un milieu de culture contenant 10 % de FBS, et semer 1 mL de suspension cellulaire diluée dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits (surface ~ 3,8 cm²) en utilisant la technique aseptique. Laisser croître dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée soit atteinte, par exemple 60 à 90 % de confluence à la récolte.
   note: La dilution appropriée de la suspension cellulaire qui donnera la confluence cellulaire souhaitée lors de la récolte variera d’un type de cellule à l’autre, ainsi qu’en fonction de la durée et du type de traitements expérimentaux. Par conséquent, cela doit être évalué empiriquement dans chaque cas.
   1. Pour les expériences qui doivent être à la fois traitées et récoltées 2 jours après l’ensemencement, ensemencer 2,5 x 10^{cellules 5} LNCaP, HEK293 ou MCF-7, 5 x 10⁴ MEF, 4 x 10⁵ BJ ou 1,5 x 10⁵ cellules RPE-1 dans chaque puits de la plaque à 12 puits.
   2. Pour les cellules qui adhèrent librement, enduire les plaques du type de revêtement recommandé pour le type de cellule en question. Pour les cellules LNCaP (et HEK293), utilisez des plaques recouvertes de poly-D-lysine (PDL).
   3. À cette fin, ajoutez 500 μL de PDL à 2,5 μg/mL dans du H₂O stérile dans chaque puits et incubez les plaques dans un environnement stérile pendant 30 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). Retirer la LDP par aspiration et laver brièvement chaque puits avec 1 mL stérile de H₂O.
      note: Généralement, l’étape 1.2.1 est effectuée sans aucun traitement expérimental. Cependant, si vous effectuez une ARNi, il peut être pratique de commencer une transfection inverse avec l’ensemencement.
3. Effectuer des traitements expérimentaux dans des puits en double ou en triple par condition.
   1. Par exemple, traitez les cellules avec 50 nM de l'inhibiteur de mTOR Torin1, qui est généralement un inducteur efficace de séquestration autophagique, ou soumettez les cellules à une privation aiguë de sérum et d'acides aminés en lavant les cellules avec 1 mL de milieu sans acides aminés, puis incubez les cellules dans 1 mL d'EBSS dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) à 37 °C.
   2. Laisser un ensemble de puits non traités afin de définir les niveaux de fond de lactate déshydrogénase (LDH) sédimentable.
   3. Ajouter une quantité saturante de l’inhibiteur de post-séquestration, la bafilomycine A1 (Baf), en l’absence ou en présence des traitements expérimentaux, 3 à 4 heures avant le prélèvement cellulaire. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C.
      1. Utilisez un Baf de 100 nM pour les cellules LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 et RPE-1, et un Baf de 10 nM pour les MEF.
      2. Pour les traitements expérimentaux qui n’ont qu’une durée de 3 à 4 heures (comme ceux illustrés à l’étape 1.3.1 ont généralement), ajoutez Baf en même temps que les traitements. Pour des traitements expérimentaux plus longs, attendez 3-4 h avant la récolte et ajoutez 2 μL d’un stock de Baf concentré 500x directement dans le milieu.
      3. Mélangez en agitant la plaque immédiatement après l’ajout de Baf. À ce stade, il est également recommandé d’ajouter des inhibiteurs de séquestration macroautophagiques comme témoins, par exemple, 10 mM de l’inhibiteur de la pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) 3-méthyl adénine (3MA), ou 10 μM de l’inhibiteur sélectif de classe III de PI3K SAR-405.

2. Récolte de cellules et préparation à l’électroperturbation

1. À la fin de la période de traitement, aspirer le milieu avec aspiration et ajouter 200 μL de solution de détachement cellulaire (préchauffée à 37 °C) dans chaque puits. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent (généralement environ 5 min).
   note: Alors que la trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v) peut être utilisée à la place de la solution de détachement cellulaire, cette dernière contient de la DNase, qui aide à réduire la viscosité des cellules détachées. Tant que le milieu est complètement aspiré, il n’est pas nécessaire de laver les cellules avant l’ajout de Trypsine-EDTA ou de solution de détachement cellulaire.
2. Ajouter 500 μL de PBS à température ambiante (20-25 °C), pH 7,4, contenant 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits, et remettre en suspension avec la pipette jusqu’à ce qu’aucun amas de cellules ne soit visible. Transférez immédiatement la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace.
   note: Sauf indication contraire, effectuez toutes les étapes suivantes sur la glace.
3. Sédimenter les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
4. Aspirez soigneusement le surnageant (avec aspiration) pour laisser les granules de cellules aussi sèches que possible.
5. Ajouter 400 μL de saccharose à 10 % (p/v) (en H₂O ultrapur) dans chaque tube.

3. Électroperturbation par membrane plasmique et séparation des fractions sédimentables et totales des cellules

1. Remettre en suspension la pastille de cellule à l’aide d’une pipette pour obtenir une suspension presque unicellulaire, et la transférer dans une cuvette d’électroporation de 4 mm.
   note: Le pipetage de haut en bas ~10 à 15 fois, à l’aide d’une pointe de pipette de 100 à 1 000 μL, est généralement suffisant.
2. Placez la cuvette dans un électroporateur à ondes de décroissance exponentielle et déchargez une seule impulsion électrique à 800 V, 25 μF et 400 Ω ; ces réglages produisent une impulsion d’une durée de ~8 ms.
3. À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, transférez le perturbateur cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 400 μL de solution de saccharose tamponnée au phosphate glacée (100 mM de monophosphate de sodium, 2 mM de dithiothréitol (DTT), 2 mM d’EDTA et 1,75 % de saccharose, pH 7,5), et mélangez brièvement par pipetage.
   1. Facultatif : Pour vérifier l’efficacité de l’électro-perturbation de la membrane plasmique, mélangez 10 μL du perturbateur cellulaire dilué de l’étape 3.3 avec 10 μL de bleu de trypan à 0,4 % dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Transférez dans une chambre de comptage et vérifiez que le pourcentage de cellules positives au Trypan Blue est de >99 %.
      1. Laissez l’échantillon dans la chambre de comptage pendant 30 minutes à température ambiante (20-25 °C) et vérifiez que le pourcentage de cellules positives au Trypan Blue est resté >99 %.
   2. Facultatif : Pour vérifier que l’électro-perturbation n’a pas été trop dure, c’est-à-dire qu’elle n’a pas perturbé les organites intracellulaires, effectuez les étapes 1.1 à 3.3 comme décrit ci-dessus, mais utilisez un matériau de départ plus grand (un puits d’une plaque à 6 puits avec une couche cellulaire confluente de ~80 %), et utilisez 150 μL de saccharose à 10 % à l’étape 2.5 et 150 μL de solution de saccharose tamponnée au phosphate sans DTT à l’étape 3.3.
      1. À l’aide d’une pipette, superposer soigneusement 200 μL de la solution de rupture cellulaire diluée sur un coussin de densité de 1,2 mL de milieu à gradient de densité de 8 % (p/v) tamponné au phosphate (p. ex., 8 % de Nycodenz, 50 mM de phosphate de sodium, 2,2 % de saccharose, 1 mM d’EDTA) dans un tube à centrifuger de 2 mL. Centrifugez à 20 000 x g pendant 45 min à 4 °C dans une microcentrifugeuse avec fonction soft-mode (pour une accélération et une décélération douces), et posez soigneusement les tubes sur de la glace.
      2. Retirez avec précaution 60 μL de la fraction supérieure de ~200 μL, en veillant à ne pas prélever de solution de milieu à gradient de densité, et transférez-la dans un tube de microcentrifugation frais.
         note: Celui-ci doit contenir du cytosol d’une pureté exceptionnelle, appelé « sève cellulaire ».
      3. Testez la pureté de la fraction obtenue à l’étape ci-dessus, en effectuant des analyses par western blot de protéines contenues dans des organites, à l’aide de techniques standard et de gels à gradient de 4 à 20 %.
      4. Effectuez par exemple l’immunotransfert pour la cathepsine B, le cytochrome c et la disulfure isomérase de protéine, pour vérifier que le choc électrique de l’étape 3.2 n’a pas perturbé les lysosomes, les mitochondries ou le réticulum endoplasmique, respectivement, et l’immunotransfert pour la LDH pour vérifier la présence d’une protéine cytosolique dans la sève cellulaire.
      5. En parallèle, effectuer un immunotransfert sur des extraits de protéines fabriqués à partir de la solution totale de perturbation cellulaire pour confirmer que les anticorps utilisés peuvent détecter les protéines contenant des organites qui sont évaluées.
4. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 pour chaque échantillon.
5. Prélever 550 μL de chaque solution de perturbateur cellulaire diluée (obtenue à l’étape 3.3) dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL contenant 900 μL de tampon de remise en suspension glacé (50 mM de monophosphate de sodium, 1 mM de DTT, 1 mM d’EDTA et 5,9 % de saccharose, pH 7,5) complété par 0,5 % de BSA et 0,01 % de Tween-20, et mélanger brièvement par pipetage.
6. Centrifugeuse à 18 000 x g pendant 45 min à 4 °C pour produire des granulés contenant de la « LDH sédimentée ». Aspirez soigneusement le surnageant (avec aspiration) pour laisser les granulés aussi secs que possible. Placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C.
7. Transférez 150 μL de chaque solution de perturbation de cellule diluée (obtenue à l’étape 3.3) dans de nouveaux tubes et placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C. Utilisez ces échantillons pour déterminer les niveaux de « LDH totale » dans les cellules.
   note: À ce stade, l’expérience peut être interrompue aussi longtemps que souhaité.

4. Extraction de la LDH et mesure de l’activité enzymatique de la LDH

1. Décongeler les échantillons de « LDH sédimentée » (de l’étape 3.6) et de « LDH totale » (de l’étape 3.7) sur de la glace.
2. Ajouter 300 μL de tampon de remise en suspension glacé contenant 1,5 % de Triton X-405 aux échantillons de « LDH totale » (ce qui donne une concentration finale de Triton X-405 de 1 %). Faites pivoter les échantillons sur un rouleau dans une chambre froide (4 à 8 °C) pendant 30 min.
3. Ajouter 750 μL de tampon de remise en suspension glacé avec 1 % de Triton X-405 aux échantillons de « LDH sédimentée » et remettre les granulés en suspension à l’aide d’une pipette jusqu’à l’obtention d’une solution homogène.
4. Centrifuger les échantillons des étapes 4.2 et 4.3 à 18 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour sédimenter les débris cellulaires non dissous.
5. Mélangez 4 parties d’imidazole froid 65 mM (pH 7,5)/0,75 mM de pyruvate avec une partie d’imidazole froid 65 mM (pH 7,5)/1,8 mM NADH pour obtenir une solution de travail stable pendant au moins trois semaines à 4 °C.
6. Mélangez 3 à 30 μL des surnageants de l’étape 4.4 avec 200 μL de la solution de travail de l’étape 4.5.
7. Déterminez la quantité de LDH en mesurant l’activité enzymatique de la LDH comme la baisse de l’absorbance du nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) (NADH) à 340 nm à 37 °C par rapport à un étalon avec une concentration de LDH connue. Effectuer des mesures d’absorbance jusqu’à ce que la réaction soit presque terminée, c’est-à-dire jusqu’à ce que l’absorbance à 340 nm ne change plus avec le temps.
   note: Il s’agit de la méthode biochimique classique pour mesurer l’activité de la LDH. Bien que le protocole actuel effectue la réaction à 37 °C, elle peut également être effectuée à température ambiante (20-25 °C), ce qui est conseillé si vous faites de la spectrophotométrie manuelle. Le protocole actuel utilise un instrument robotisé multi-analyseur qui, de manière automatisée, mélange des échantillons avec une solution de travail dans une plaque de 96 puits et mesure l’absorbance à 340 nm à 37 °C toutes les 20 s pendant 3 min. Par la suite, le logiciel de l’instrument calcule la concentration de LDH, exprimée en unités (U)/L, en comparant la pente des mesures d’absorbance au fil du temps par rapport à une courbe standard obtenue par étalonnage avec un étalon de concentration de LDH connue. La plage linéaire de détection par cette approche est de 30 à 1 500 U/L. Il existe également une grande variété de kits disponibles dans le commerce pour mesurer la LDH. Certains d’entre eux sont basés sur le couplage de la réaction enzymatique à la génération de produits colorimétriques ou fluorescents, permettant la détection par d’autres moyens que la spectrophotométrie UV, et avec d’autres plages linéaires de détection.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et 2 ml	Eppendorf	211-2130 et 211-2120
Plaques à 12 puits	Faucon	353043
Solution de décollement de cellules Accumax	Technologies cellulaires innovantes	A7089	Conservez les aliquotes à -20 °C pendant des années et au réfrigérateur pendant quelques mois
Bafilomycine A1	Enzo	BML-CM110-0100	Dissoudre dans le DMSO
Cellules BJ	ATCC	CRL-2522	Utilisation au passage <30
Albumine sérique bovine (BSA)	VWR	Réf. 422361V
Chambre de comptage Burker	Fisher Scientific	Référence 139-658585
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	ThermoFisher Scientfic	Réf. C10228
Compteur de cellules automatisé Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Verre de protection pour la chambre de comptage Burker	Fisher Scientific	139-658586
Gel Criterion Tris-HCl, 4 à 20 %, 26 puits, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (L x L)	Bio-Rad	3450034
La TNT	Sigma-Aldrich	D0632
Solution saline équilibrée d'Earle (EBSS)	Gibco	Référence 24010-043	Contient 0,1 % de glucose
Edta	Sigma-Aldrich	E7889
Cuvette d’électroporation (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Électroporateur à ondes de désintégration exponentielle	Appareil BTX Harvard	CEM 630
Sérum fœtal bovin (FBS)	sigma	F7524	Concentration finale de 10 % dans le milieu RPMI 1640
Cellules HEK293	ATCC	CRL-1573
Imidazole	Sigma-Aldrich	Référence 56750	Autoclavez une solution de 65 mM et conservez-la au réfrigérateur pendant des mois
incubateur; Incubateur à CO2 Autoflow IR Direct Heat	NuAire	NU-5510E
Réactif de transfection de lipofectamine RNAiMAX	ThermoFisher	13778150
Cellules LNCaP	ATCC	CRL-1740	Utilisation au passage <30
3-méthyladénine (3MA)	Sigma-Aldrich	Référence M9281	Chauffer le produit à 65 °C pendant 10 minutes et l’utiliser à une concentration finale de 10 mM
Microcentrifugeuse réfrigérée	Beckman Coulter Sciences de la vie	368831
Microcentrifugeuse réfrigérée avec fonction soft-mode	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 chlorhydrate (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inhibe l’activité de la kinase ULK. Dissoudre dans le DMSO.
Instrument multi-analyseur MaxMat	Erba Diagnostics	PL-II
Cellules MCF7	ATCC	HTB-22
Nadh	Merck-Millipore	Référence 1.24644.001
Nycodenz	Bouclier d’axe	1002424
Opti-MEM Sérum Réduit Moyen	ThermoFisher	31985062
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	Référence 20012-019
Pointes de pipette 3 (0,5-20 μl)	VWR	Référence 732-2223	Thermo Fischer ART Pointes de barrière
Pointes de pipette (1-200 μl)	VWR	Référence : 732-2207	Thermo Fischer ART Pointes de barrière
Pointes de pipette (100-1000μl)	VWR	Référence 732-2355	Thermo Fischer ART Pointes de barrière
Pipettes	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 Kit BPL
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Préparez une solution mère de 1 mg/ml dans du H2O stérile. Cette solution est stable à -20 °C pendant au moins 1 an.
Pyruvate	Merck-Millipore	1066190050
Cellules RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	Référence 21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inhibe la phosphoinositide 3-kinase de classe III (PIK3C3). Dissoudre dans le DMSO.
Silencieux Select Negative Control #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
SiRNA ciblant l’ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	Réf. S35504
Silencer Select FIP200-ciblant le siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
SiRNA ciblant ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
SiRNA ciblant ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
Silencieux Select siRNA ciblant GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	Réf. s22362
Silencer Select GABARAPL1-ciblant le siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	Réf. 24333
SiRNA à ciblage GABARAPL2 Silencer Select (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
Phosphate de sodium monobasique dihydraté (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	Référence 1.06580.1000
Phosphate de sodium dibasique dihydraté (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	Référence 28014.291
saccharose	VWR	Réf. 443816T	Concentration finale de 10 % dans l’eau ; filtrer à travers un filtre de 0,45 μm et conserver au réfrigérateur pendant des mois
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	Réf. T9033	Inhibe la pompe SERCA ER Ca2+. Dissoudre dans le DMSO.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1 % final
Trypan Teinture Bleu 0.4 %	Sondes moléculaires	Réf. T10282
Trypsine-EDTA (0,25 % p/v de trypsine)	Gibco	Référence 25200-056
Préadolescent-20	Sigma-Aldrich	Réf. P2287	0,01 % final