Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

1. Conditions de culture de la protéine fluorescente verte exprimant M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP)

REMARQUE : La souche auxotrophe mc^{2 6206}dérivée de M. tuberculosis H37Rv (ΔpanCD, ΔleuCD) transformée avec le plasmide pMN437 exprimant la protéine fluorescente verte (gfp) est utilisée tout au long de ce protocole. Il est possible de remplacer la souche Mtb-GFP par une souche de type sauvage n’exprimant pas de gfp afin de faciliter l’accessibilité de la souche pour les chercheurs. Cependant, l’expression de gfp est souhaitable pour permettre la confirmation visuelle de la phagocytose et la formation d’agrégats Mtb/macrophages. Pour l’entreposage à long terme, les Mtb-GFP ont été congelés à -80 °C dans un milieu 7H9 complet (décrit à l’étape 1.1) complété par 20 % de glycérol.

1. Préparez un milieu complet de Mtb-GFP (7H9-C) en complétant le milieu 7H9 avec 10 % de Middlebrook OADC (albumine oléique dextrose catalase), 0,02 % de tyloxapol, 24 μg/mL d’acide D-pantothénique, 50 μg/mL de L-leucine et 50 μg/mL d’hygromycine B.
2. Décongeler un flacon de Mtb-GFP et ajouter 10 ml de 7H9-C dans une fiole en PETG à fond carré de 30 ml.
3. Incuber à 37 °C sur un agitateur rotatif (50 tr/min). Prenez des mesures de densité optique (OD₆₀₀) tous les quelques jours jusqu’à ce que OD₆₀₀ atteigne 1,0 (environ 5 à 8 jours).
4. Diluer et faire passer la culture au besoin pour maintenir une DO₆₀₀ entre 0,2 et 1,0.
5. En cas d’infection, utiliser une culture établie de Mtb-GFP dans la phase de croissance logarithmique (DO₆₀₀ de 0,6-1). Pour éviter les cultures grumeleuses, soniser la fiole de culture de Mtb dans un bain-marie (130 W ; impulsions de 3 x 5 s) une à deux fois par semaine.

2. Conditions de culture des cellules THP-1

1. Préparez un milieu cellulaire THP-1 complet (RPMI-C) en complétant le milieu RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine et 10 mM d’HEPES (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique.
2. Incuber les cellules dans une fiole T-75 à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une cytométrie en flux tous les deux jours et maintenir les cellules THP-1 à une densité comprise entre 0,1 et 0,6 million par ml.

3. Protocole d’infection pour générer des structures d’agrégats de mtb/macrophages

1. Préparation de cellules THP-1 (par plaque de 96 puits)
   1. Centrifuger 7 x 10⁶ cellules THP-1 à 250 x g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 7 mL de RPMI-C.
2. Préparation du Mtb-GFP
   1. Centrifugeuse 2,8 x 10⁸ Mtb-GFP à 3 200 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse à godet oscillant avec une conversion de_{OD 600} 1,0 = 3 x 10⁸ bactéries/mL.
   2. Lavez une fois avec RPMI-C et centrifugez comme à l’étape 3.2.1.
   3. Remise en suspension dans 7 mL de RPMI-C et vortex pendant 10 s.
3. Infection
   REMARQUE : reportez-vous à la figure 1 pour le modèle.
   1. Préparez une plaque à 96 puits en ajoutant 200 μL d’eau stérile dans les rangées A et H et les colonnes 1 et 12 pour un rebord d’eau afin d’empêcher l’évaporation du milieu de culture.
   2. Ajoutez 200 μL de RPMI-C à la colonne 2 (B2 à G2) pour la commande d’arrière-plan (Blank).
   3. Pour infecter, ajoutez la suspension Mtb-GFP (étape 3.2) à la suspension cellulaire THP-1 (étape 3.1) et mélangez bien par pipetage. La densité cellulaire finale du THP-1 est de 5 x 10⁵ par ml et la multiplicité correspondante de l’infection est de 40.
   4. Versez la suspension THP-1/Mtb-GFP dans un réservoir de 25 ml.
   5. Ajouter 200 μL de suspension THP-1/Mtb-GFP dans les 96 puits restants (B3 à G11) à l’aide d’une pipette multicanaux.
      note: Si vous travaillez avec plusieurs plaques de 96 puits, remettez régulièrement en suspension la suspension THP-1/Mtb restante dans le réservoir pour vous assurer qu’un mélange uniforme est ajouté à chaque puits.
   6. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 7 à 10 jours.
   7. Changez de média tous les 2 jours en retirant lentement 100 μL de milieu usagé du haut de chaque puits et en ajoutant doucement 100 μL de RPMI-C préchauffé à l’aide d’une pipette multicanaux. Ne pas remettre les puits en suspension et ne pas déranger les agrégats de Mtb/macrophages au fond des puits.
   8. Examiner visuellement les puits par microscopie à fluorescence (objectif 4-10X) tous les jours, en prenant note de la taille des agrégats de Mtb/macrophages. Du 7e au 10e jour, les agrégats de Mtb/macrophages devraient être suffisamment importants (voir la figure 2 pour référence) pour procéder à des tests d’efficacité du médicament (section 4).
   9. Si vous le souhaitez, capturez des images des 96 puits à l’aide d’un système d’imagerie cellulaire automatisé équipé d’ensembles de filtres en fond clair et GFP pour documenter la formation d’agrégats Mtb/macrophages.
      note: Si les utilisateurs n’ont pas accès à un système d’imagerie automatisé, des images de puits représentatifs peuvent être prises à l’aide de n’importe quel microscope approprié doté de capacités GFP et de champ clair.

4. Essai d’inhibition de la croissance pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mtb dérivé d’agrégats de Mtb/macrophages

1. Préparation médicamenteuse (conditions triples pour deux drogues)
   REMARQUE : Voir la figure 1A pour le modèle.
   1. Dans une plaque séparée à 96 puits, ajoutez 125 μL de média 7H9-C à B2 jusqu’à G10.
   2. Préparez deux médicaments au double de la concentration finale la plus élevée souhaitée dans 1 mL de 7H9-C pour tenir compte de la dilution à l’étape 4.2.4.
   3. Ajouter 250 μL de chaque médicament dans les puits B11-C11-D11 et E11-F11-G11, respectivement pour les traitements en trois exemplaires.
   4. À l’aide d’une pipette multicanaux, diluez en série les médicaments d’essai deux fois en déplaçant 125 μL de B11-G11 à B10-G10. Mélanger par pipetage 5 fois à chaque étape.
   5. Continuez à déplacer 125 μL d’une colonne à l’autre (de droite à gauche) sur la plaque et arrêtez-vous après la colonne 4.
   6. Après avoir mélangé la colonne 4, jeter 125 μL dans un conteneur à déchets. Les colonnes 2 et 3 ne doivent pas contenir de médicaments permettant une utilisation comme produit de fond (blanc) et des contrôles de croissance positifs.
      note: Vous pouvez également suivre le modèle de la figure 1B pour tester les bibliothèques de médicaments. Chaque plaque de 96 puits peut contenir 58 médicaments à une seule concentration. Préparez cette plaque de médicament en utilisant le double de la concentration finale souhaitée puisqu’elle sera diluée en deux à l’étape 4.2.4.
2. Traitement médicamenteux :
   1. Récupérer la plaque de 96 puits contenant les macrophages infectés par Mtb (agrégats Mtb/macrophages).
   2. Décanter soigneusement tous les puits concernés (B2 à G11) à l’aide d’une pipette multicanaux. Pour ce faire, procédez en deux étapes : retirez d’abord 150 μL sans incliner la plaque, puis retirez le support restant (~50 μL) en inclinant la plaque et en insérant la pointe de la pipette dans le bord inférieur du puits. Comme les agrégats de Mtb/macrophages sont adhérents au fond du puits, aucune matière ne doit être perdue.
   3. Ajouter délicatement 100 μL de milieu 7H9-C dans tous les puits pertinents (B2 à G11) de la plaque contenant les agrégats Mtb/macrophages.
   4. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 μL de la plaque à 96 puits contenant le médicament (étape 4.1) vers les puits correspondants de la plaque infectieuse.
   5. Placer dans un sac hermétique et incuber pendant 3 jours à 37 °C.

5. Quantification de l’efficacité du médicament à l’aide du test de microtitration de la résazurine

1. Préparer une solution mère de résazurine à une concentration finale de 0,8 mg/mL dans H₂O. Filtrer à travers une membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 0,22 μm pour la stérilisation.
2. Préparez la solution de travail de la résazurine en mélangeant la solution mère de résazurine,_H2O et Tween-80 (solution à 20 % dans_H2O) dans un rapport de 2:1:1. Les concentrations finales sont de 0,4 mg/mL de résazurine et de 5 % de Tween-80.
3. À l’aide d’un lecteur de plaques, configurez un programme de lecture de la fluorescence à une excitation de 530 nm et d’une émission de 590 nm toutes les 30 min pendant 24 h à 37 °C. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 °C.
4. Ajouter 20 μL de solution de travail de résazurine dans tous les puits pertinents (B2 à G11) de la plaque traitée par le médicament (étape 4.11) à l’aide d’une pipette multicanaux.
5. Placez la plaque sur le lecteur de plaques et lancez le programme configuré à l’étape 5.3.
   note: Pour faciliter le traitement de grands volumes de plaques de dosage, il suffit de développer le test dans un incubateur à 37 °C et d’effectuer des lectures de fluorescence uniques toutes les 24 h. Cela s’applique également aux utilisateurs qui n’ont pas accès à un lecteur de plaques doté de capacités cinétiques et d’incubation.

Figure 1 : Disposition de la plaque de médicament. (A) Exemple de modèle de plaque de provocation médicamenteuse utilisé à l’étape 4. Cela permet d’analyser en parallèle deux médicaments dans des puits triples à 8 concentrations définies. À titre d’expérience représentative, nous avons utilisé la rifampicine (RIF) et la moxifloxacine (MOXI) à partir de 2 μM et 2,5 μM, respectivement. (B) Un autre modèle de criblage à haut débit est également fourni pour montrer la possibilité d’essayer 58 composés à une concentration unique.

Figure 2 : Génération de structures d’agrégats Mtb/macrophages sous forme de plaques à 96 puits. (A) Images représentatives en fond clair et fusionnées GFP d’agrégats Mtb-macrophages au jour 9 après l’infection. Les images ont été capturées avec un objectif 4X à l’aide d’un programme d’imagerie cellulaire automatisé qui documente l’ensemble du puits en assemblant un montage d’images 3 par 3 capturées individuellement. (B) Une image individuelle non assemblée du champ visuel est illustrée en (A). (C) Une image représentative en fond clair et GFP fusionnée d’une structure d’agrégat Mtb/macrophage capturée avec un objectif 10X.