Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Jour 1
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes décrites ci-dessous dans une enceinte de biosécurité stérile à flux laminaire utilisée pour la culture tissulaire dans un laboratoire BSL-2.
- Décongelez les échantillons de sérum à température ambiante et transférez 100 μL de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile. Inactivation de la chaleur pendant 30 min à 56°C soit dans un bain-marie, soit dans un thermomélangeur à température réglable. Effectuez des dilutions en série de 10 fois de l’échantillon de sérum allant de 1:1 à 1:1 000 à l’aide de RPMI-10 froid (RPMI avec 10 % de sérum de bovin fœtal).
- Transférez 10 μL d’échantillon de sérum dilué en série dans chaque puits d’une plaque stérile à fond en V de 96 puits. Comprend deux ensembles de puits de contrôle, RPMI-10 avec VPR seulement et sans échantillon de sérum, et RPMI-10 uniquement sans RVP et sans échantillon de sérum. Configurez chaque échantillon de sérum et les commandes RPMI-10 en trois exemplaires.
- Sortez les VPR de Dengue-1, 2, 3 et 4 du congélateur à -80 °C et décongelez-les dans un bain-marie à 37 °C. Transférez immédiatement les VPR décongelés dans de la glace. Obtenir environ 170 μL de VPR pour chaque échantillon de sérum (10 μL de VPR x 3 puits pour chaque dilution sérique (1:1, 1:10, 1:100, 1:1 000) et 10 μL de VPR x 3 puits pour chacun des RPMI-10 avec des puits de contrôle RVP uniquement).
- Pipeter 10 μL de VPR dans chaque puits de la plaque à fond en V de 96 puits contenant l’échantillon de sérum et dans le RPMI-10 avec des puits de contrôle RVP (sans sérum). N’ajoutez pas de VPR dans les puits du RPMI-10 uniquement (pas d’échantillon de sérum ni de PVR). Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois. Ajouter 10 μL de RPMI-10 froid au lieu de VPR dans chaque puits de contrôle RPMI-10 froid seulement (sans échantillon de sérum ni VPR).
- Transférez la plaque à fond en V de 96 puits dans un incubateur et incubez la plaque pendant 1 heure à 37 °C en présence de 5 % de CO2. Pendant que la plaque inférieure en V de 96 puits est en incubation, nettoyez la surface de l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 70 % et faites fonctionner la lumière UV pendant 15 min.
- Retirez de l’incubateur une fiole T75 entièrement confluente de cellules K562, mélangez bien les cellules à l’aide d’une pipette stérile de 5 mL et transférez 5 mL de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL.
note: Les cellules K562 sont maintenues dans RPMI-10 et sous-cultivées à raison de 1 x 106/mL.
- Comptez le nombre de cellules en prélevant 10 μL de cellules du tube conique stérile de 15 ml et mélangez avec 10 μL de bleu de tryphane. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules dans le tube conique de 15 ml.
- Centrifuger le conique de 15 mL avec des cellules à ~1 200 x g pendant 10 minutes, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du RPMI-10 chaud à une concentration de 80 000 cellules/30 μL de milieu (2,66 x 106 cellules/mL).
- Retirez la plaque à fond en V à 96 puits de l’incubateur (étape 1.6), transférez 30 μL de cellules K562 dans chaque puits de la plaque à fond en V à 96 puits et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois. Transférez la plaque à fond en V à 96 puits dans un incubateur et incubez la plaque pendant 1 heure à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
- Après 1 h d’incubation, retirer la plaque inférieure en V à 96 puits de l’incubateur et centrifuger à ~1 200 x g pendant 5 minutes. Après la centrifugation, décantez le média des puits en retournant la plaque dans un récipient contenant 10 % d’eau de Javel.
- Lavez les cellules de chaque puits en les remettant en suspension dans 125 μL de RPMI-10 chaud, mélangez soigneusement avec une pipette et centrifugez la plaque à ~1 200 x g pendant 5 min. Décantez le support en retournant la plaque dans un récipient contenant 10 % d’eau de Javel. Répétez cette étape de lavage deux fois.
- Après le lavage, ajouter 100 μL de RPMI-10 chaud dans chaque puits, mélanger de haut en bas avec la pipette et incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
2. Jour 3
- Retirez de l’incubateur la plaque à fond en V de 96 puits contenant 100 μL de cellules et de milieux/puits et déplacez-la dans une enceinte de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélangez le contenu de chaque puits et transférez les cellules et le milieu dans une plaque à fond en U de 96 puits ou des tubes en polypropylène pré-étiquetés de 5 ml.
- Rincer chaque puits dans la plaque à fond en V de 96 puits avec 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et transférer dans les puits respectifs dans la plaque à fond en U à 96 puits ou des tubes en polypropylène de 5 mL étiquetés à l’étape 2.1 pour obtenir une concentration finale de 0,5 % de PFA/puits ou tube. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux, couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et laissez-la reposer dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer les cellules.
- Préparez le cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux par exemple) en faisant fonctionner des cellules K562 non colorées pour calibrer la diffusion latérale et vers l’avant ainsi que les paramètres de fluorescence. Le seul canal de fluorescence requis est FL1, car la GFP est la seule fluorescence émise par les cellules. Acquisition de ~30 000 à 50 000 cellules à partir de chaque échantillon.
note: Tout cytomètre en flux capable de lire une seule fluorescence peut être utilisé pour acquérir les données, car les cellules infectées par les RVP n’émettront que de la fluorescence verte en raison de la présence de GFP, et aucun autre canal de fluorescence n’est nécessaire.
3. Analyse des données
- Analysez les données acquises sur le cytomètre en flux à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir Tableau des matériaux).
- Réglez la première porte basée sur FSC-A (diffusion vers l’avant – aire) et FSC-H (diffusion vers l’avant – hauteur) pour inclure les cellules simples et exclure les doublets auto-fluorescents de l’analyse. Ensuite, les cellules singulet à porte sont basées sur SSC-A (diffusion latérale – surface) par rapport à FSC-A pour exclure tout débris autofluorescent.
- Analysez les cellules fermées SSC-A et FSC-A pour l’expression de la GFP basée sur SSC-A et GFP-A. Déterminez le pourcentage de cellules GFP+ pour chaque dilution du sérum et des échantillons de contrôle en plaçant une porte autour des cellules GFP+.
- Déterminez le pourcentage moyen de cellules GFP+ pour chaque puits de dilution et de contrôle d’échantillon de sérum en divisant par 3 le pourcentage total de cellules GFP+ dans les puits triples.
- Calculez l’amélioration du repliement de l’infection en divisant le pourcentage moyen de cellules GFP+ dans les échantillons de sérum pour chaque dilution par le pourcentage moyen de cellules GFP+ dans le RPMI-10 avec puits de contrôle RVP (sans échantillon de sérum).
- Visualisez l'amélioration du pli (axe des y) en fonction de la dilution (axe des x) et effectuez une analyse statistique à l'aide de l'ANOVA suivie du test post-hoc de Tukey pour les comparaisons multiples.
