1. Dépistage de nano-inhibiteurs potentiels de TLR4 à l’aide des cellules rapporteures
REMARQUE : Étant donné que la signalisation TLR4 utilise à la fois des voies terrestres dépendantes de MyD88 et dépendantes de TRIF, elle est sélectionnée comme cible principale pour englober un large éventail de voies de signalisation TLR. Les cellules rapporteures THP-1-XBlue sont principalement utilisées pour examiner l’activation de NF-κB/AP-1, tandis que les cellules THP-1-Dual sont destinées à l’activation IRF à partir de la transduction du signal dépendante du TRIF.
- Identifier la dose optimale de LPS en générant une courbe dose-réponse avant le dépistage.
- Diluer la solution de travail LPS à une concentration finale de 0,01 à 100 ng/mL dans le milieu R10 (faire dilution sur une échelle log10). Disposez la conception de la plaque et faites la dilution dans une plaque de culture à fond rond de 96 puits. Assurez-vous que chaque puits a un minimum de 110 μL de solution après dilution.
- Retirez délicatement le milieu de culture de la plaque enracinée à l’aide d’un aspirateur.
- Transvaser le milieu contenant du LPS contenant du R10 préparé dans la plaque de dilution (1.1.1) dans la plaque de culture selon la disposition des échantillons. Incuber la plaque à 37 °C (dans un incubateur de culture cellulaire) pendant 24 h.
- À 24 h, transférez soigneusement les surnageants (80 μL/puits) dans une nouvelle plaque à fond rond de 96 puits. Effectuer immédiatement le test de luminescence colorimétrique et/ou luciférase sur ces solutions ou les stocker à 4 °C (plusieurs heures) ou -20 °C (jours) avant le développement du test.
note: La conception de la disposition des plaques doit être simple et claire pour l’expérience et l’analyse des données. Pour chaque condition, 2 à 4 répétitions doivent être envisagées. Incluez toujours un groupe de contrôle négatif (LPS null). Il est recommandé d’utiliser des cellules THP-1-XBlue pour l’activation de NF-κB/AP-1 car les cellules Dual ont un fond d’activation NF-κB/AP-1 relativement élevé après avoir été différenciées en macrophages. Cependant, il est possible d’utiliser les cellules doubles pour signaler à la fois l’activation de NF-κB/AP-1 et de l’IRF.
- Développer le test colorimétrique pour l’activation de NF-κB/AP-1 et le test de luminescence de la luciférase pour l’activation de l’IRF.
- Pour évaluer l’activation de NF-κB/AP-1, transférez 20 μL de surnageant de chaque échantillon dans une nouvelle plaque de culture à fond plat à 96 puits, et ajoutez 180 μL de solution de substrat PAED préchauffée dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 à 2 h pour permettre le développement de la couleur (rose à bleu foncé). Recueillir l’absorption à 655 nm sur un lecteur de plaques.
prudence: Le temps d’incubation peut être varié en fonction du développement de la couleur (30 min jusqu’à l’incubation d’une nuit). Il est recommandé d’attendre que la densité optique (D.E.) de la couleur la plus foncée atteigne plus de 1 tout en évitant la saturation du développement de la couleur (D.O. >3).
- Pour l’analyse de l’activation de l’IRF, transférez 10 μL de surnageant de chaque échantillon dans une plaque blanche transparente à fond plat à 96 puits. Ajouter la solution de luciférase (50 μL) et recueillir immédiatement la luminescence puits par well.
note: Il est fortement recommandé d’utiliser un lecteur de plaques de luminescence avec une fonction d’auto-injection pour assurer la cohérence de la lecture de la luminescence de puits à puits et de plaque à plaque. Si les solutions de substrat sont injectées manuellement, veuillez vous assurer que le temps d’incubation et la configuration de lecture sont constants pour chaque puits.
- Effectuer l’essai de dépistage sur divers hybrides peptide-GNP avec une stimulation LPS de 10 ng/mL (sur la base de 1,1). Suivez la même procédure en 1.2 pour le développement du test rapporteur.
- Concentrer les hybrides peptide-GNP à 200 nM dans un milieu R10 en utilisant la méthode de centrifugation. Centrifugez 20 volumes de la solution hybride (10 nM) à 18 000 x g pendant 30 min, et jetez soigneusement les surnageants. Recueillez les hybrides (au fond du tube) dans un tube, lavez-les deux fois avec du PBS et remettez les hybrides en suspension dans un volume de milieu R10.
- Mélanger des volumes égaux d’hybrides concentrés et de LPS (20 ng/mL) contenant du milieu R10 pour obtenir une concentration finale des hybrides et du LPS de 100 nM et 10 ng/mL, respectivement.
- Retirer le milieu de culture de la plaque de culture et ajouter 100 μL de la solution mélangée dans chaque puits (3 répétitions pour chaque condition) ; inclure un témoin négatif (milieu seulement) et un témoin LPS (10 ng/mL de LPS sans hybrides).
- Après une incubation de 24 h à 37 °C, transvaser le milieu de chaque puits dans un tube et centrifuger les tubes à 18 000 x g, 4 °C pendant 30 min. Prélever les surnageants (50-80 μL/tube) dans une plaque à fond rond de 96 puits et effectuer le test rapporteur comme décrit à la section 3.2.
prudence: Lors de la mise au rebut des surnageants après centrifugation, ne pas agiter les hybrides au fond du tube.
note: La centrifugation à l’étape 1.3.4 est très importante pour éliminer les hybrides de nanoparticules non internalisés du milieu de culture, et peut éviter l’interférence des hybrides avec les lectures colorimétriques/luminescences. En effet, les nanoparticules d’or peuvent absorber de grandes longueurs d’onde de lumière en fonction de leur taille et de leur agglomération.
2. Validation de l’effet inhibiteur des candidats potentiels
REMARQUE : Pour confirmer l’effet inhibiteur des candidats potentiels issus du criblage, deux approches sont utilisées. L’une consiste à examiner les doses-réponses des stimulants (LPS) à une concentration hybride fixe (ou l’inverse) ; l’autre consiste à examiner directement l’inhibition des signaux NF-κB/AP-1 et IRF3 via l’immunoblottage.
- Dans la première approche, effectuer l’essai rapporteur avec 100 nM d’hybrides de plomb et deux concentrations de LPS à 1 ng/mL et 10 ng/mL en suivant les mêmes procédures décrites à la section 1.3. Inclure un hybride inactif (sur la base des résultats du dépistage) comme contrôle hybride à des fins de comparaison.
- Pour l’approche par immunobuvardage, veuillez suivre les procédures expérimentales standard.
- Cultivez des cellules THP-1 dans un milieu R10, ensemencez-les dans une plaque de culture à 12 puits (2 x 106 cellules/puits) et différenciez-les en macrophages en traitant les cellules avec 50 ng/mL de PMA pendant 24 h, puis en les reposant pendant 2 jours.
- Après la différenciation cellulaire, stimuler les cellules avec 10 ng/mL de LPS avec/sans les hybrides (100 nM) au fil du temps (jusqu’à 4 h). À différents moments (0, 5, 15, 30, 60, 120 et 240 min), préparez les lysats cellulaires pour l’immunobuvardage. Incluez un hybride inactif comme contrôle.
- Sondez les signaux d’IκBα, de p65 phosphorylé et d’IRF3 phosphorylé pour examiner l’effet inhibiteur des hybrides de plomb sur l’activation de NF-κB et IRF3. Sonde la β-actine et des signaux IRF3 totaux en tant que contrôles internes.
note: La transduction du signal se produit souvent beaucoup plus rapidement (en quelques heures) que l’expression des enzymes rapporteures SEAP et luciférase (24 h). Il est fortement recommandé d’effectuer également un test de viabilité des hybrides testés à 24 h comme autre méthode de validation.
3. Évaluation de la spécificité TLR
REMARQUE : Pour étudier la spécificité TLR de l’hybride peptide principal-GNP, d’autres voies de signalisation TLR sont testées, notamment TLR2, TLR3 et TLR5. TLR7, 8 et 9 sont exclus car les macrophages dérivés de THP-1 ne répondent pas bien à la stimulation de ces TLR en raison du manque d’expression de TLR7, 8 et 9 dans les macrophages.
- Tester diverses concentrations (1 ng/mL à 25 μg/mL) des ligands spécifiques de TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I :C) et TLR5 (flagelline) sur les deux macrophages dérivés de cellules rapporteures pour obtenir la concentration optimale en suivant la même procédure en 1.1 et 1.2.
- Traiter les cellules avec les mélanges de l’hybride de plomb (100 nM) et de chaque ligand TLR à la concentration obtenue à partir de 3.1 pour évaluer la spécificité inhibitrice de l’hybride de plomb selon la procédure expérimentale décrite en 1.3. Incluez l’hybride inactif comme contrôle à des fins de comparaison.
