Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des organes
REMARQUE : Le virus n’est pas stable à température ambiante, de sorte que le nombre d’animaux récoltés en même temps doit être planifié avec soin pour préserver les titres viraux.
- Infectez les souris en utilisant la dose et la voie choisies, en fonction du phénotype requis. Pour ce protocole, infectez des souris C57BL/6 mâles et femelles de 8 à 10 semaines déficientes en récepteur de l’interféron de type I (Ifnar1-/-).
- Anesthésie les souris Ifnar1-/- avec un cocktail de kétamine (90 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Testez le réflexe de la pédale par un pincement ferme de l’orteil pour confirmer l’anesthésie. Administrer 1 x 105 unités focalisantes (FFU) de ZIKV dans 50 μL par voie sous-cutanée (SC) via le coussinet plantaire.
- Préparez tout le matériel nécessaire à la récolte la veille 2 ciseaux, une pince et 20 mL d’éthanol à 70 % (EtOH) dans un cône de 50 mL pour la désinfection des outils.
- Préparez des seringues et des aiguilles : une seringue de 20 ml pour la perfusion, des aiguilles de 23 g (environ 1 par cage) et une seringue de 1 ml avec des aiguilles de 25 g (1 pour 3 à 5 souris). Avant de peser les tubes, ajoutez des billes d’acier (dans la hotte) dans des tubes à bouchon à vis à joint torique de 1,5 ml (un pour chaque organe). Les tubes doivent être adaptés à l’homogénéisation.
- Préparez le jour de la récolte les matériaux nécessaires à la perfusion et à la congélation des organes.
- Remplissez un seau à glace avec de la glace sèche et 70 % d’EtOH pour faire un bain de glace. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile en supposant que 25 à 30 ml de PBS par souris pour chaque perfusion sont nécessaires et 5 à 10 ml pour la moelle épinière. Obtenez une anesthésie, un cocktail de kétamine et de xylazine, et supposez 300 μL par souris. Placez tout le matériel et tous les tubes supplémentaires nécessaires à la cytométrie en flux, etc., dans un contenant secondaire pour le transport vers l’animalerie.
- Suivez toutes les procédures nécessaires pour entrer, y compris l’enfilage et le retrait de l’équipement de protection individuelle lors de l’entrée et de la sortie de l’animalerie.
prudence: Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité certifiée au sein d’un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL-2).
- Administrer l’anesthésie, de 200 à 500 μL, par voie intrapéritonéale en fonction de la taille et du poids de l’animal. Si vous travaillez seul, administrez l’anesthésie à un animal à la fois pour éviter de tuer les animaux avant le prélèvement d’organes.
- Confirmez la dose d’anesthésie en pinçant l’orteil avec une pince pour évaluer le réflexe de la pédale. Ne continuez pas à moins que vous ne répondiez complètement. Utilisez des épingles pour fixer la souris à une planche de cire. À ce stade, arrosez la souris d’éthanol à 70 % pour éviter la contamination des cheveux lors de la procédure de prélèvement d’organes.
- Saignement terminal par ponction cardiaque.
- À l’aide des ciseaux et de la pince, ouvrez l’animal par la cavité thoracique pour exposer le cœur. Prélever du sang par ponction cardiaque (~800 μL), cela peut être utilisé pour plusieurs tests, notamment la chimie clinique, l’hématologie, la cytométrie en flux pour détecter les réponses spécifiques à l’antigène et la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour l’analyse du nombre de copies virales.
- Pour l’analyse de l’ARN viral par qRT-PCR, prélever du sang dans un tube EDTA s’il s’agit d’une extraction à partir de sang total ou dans un tube de microcentrifugation si vous extrayez à partir d’un sérum. (Pour le sérum, faites tourner le tube à vitesse maximale dans une centrifugeuse, à température ambiante, pendant 20 min, et retirez le sérum dans un tube séparé). Ajouter un polyacrylamide linéaire comme support à l’échantillon de sérum après la finition. L’ARN peut ensuite être analysé ou stocké à -80 °C pour être traité ultérieurement.
- Remplissez la seringue de 20 ml de PBS, à température ambiante (ou 37 °C), et perfuser les souris en insérant l’aiguille papillon dans le ventricule gauche. Perforer l’oreillette droite pour permettre au sang et au PBS de s’échapper. Administrez lentement le PBS tout en vérifiant la couleur du foie pour confirmer que l’animal est complètement perfusé. Le foie doit passer d’un rouge foncé à une couleur saumon rose.
- Si vous préparez les organes pour l’histologie, laissez l’aiguille papillon en place, puis perfuser avec 20 ml de paraformaldéhyde glacé à 4 %. Si c’est le cas, il est pratique d’avoir la seringue connectée à un robinet d’arrêt à 3 voies avec les deux seringues attachées à celui-ci, en allumant et fermant la valve lorsque l’on alterne entre PBS et PFA.
- Prélever les organes dans des tubes étiquetés et pesés. Pour les organes périphériques, suivez un ordre établi pour la récolte : foie, rate, reins et poumons.
- Prenez un seul lobe du foie, peu importe lequel, mais pour toutes les expériences, essayez toujours de prendre le même lobe avec le même morceau de taille. De même, pour les reins et les poumons, prenez le même rein et le même poumon. Si la cytométrie en flux doit également être terminée, n’importe quel organe peut être coupé en deux. Conservez la moitié à utiliser pour la cytométrie dans le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) à température ambiante jusqu’à ce que la récolte soit terminée.
- Immédiatement après la récolte, placez chaque organe dans un tube étiqueté et placez-le dans le bain de glace sèche. Le titre du virus diminue avec le temps à température ambiante, de sorte que le temps nécessaire au prélèvement d’organes est extrêmement important. Il doit y avoir une cohérence entre les souris, donc après la sécurité, la priorité suivante est la vitesse.
note: Si vous prélevez des organes pour des titres viraux, il est très utile d’avoir un deuxième individu qui prélève le cerveau à ce stade, afin de préserver les titres viraux.
- Retirez les organes restants de la cavité corporelle de la souris pour accéder à la colonne vertébrale et au crâne.
- Retirez la souris du plateau et retirez la peau, puis retirez les bras et les jambes.
Retirez la tête de la souris avec des ciseaux de décapitation, contondants ou chirurgicaux pour récolter le cerveau en coupant le crâne avec des ciseaux LaGrange dentelés à travers le foramen magnum. Ensuite, décollez le crâne à l’aide d’une pince et retirez le cerveau à l’aide d’une spatule.
- À l’aide de ciseaux solides et émoussés, retirez les côtes et les autres os entourant la colonne vertébrale. Ensuite, coupez à travers l’os pelvien, exposant le foramen vertébral au niveau lombaire. La petite pointe de la moelle épinière devrait être visible à ce stade.
- À l’aide d’une seringue de 10 ml remplie de PBS et d’une aiguille de 18 G, expulsez la moelle épinière en « rinçant » le cordon de la colonne lombaire à la colonne cervicale au-dessus d’une boîte de Pétri.
- Soigneusement, placez la pointe biseautée de l’aiguille à l’intérieur du foramen vertébral, en évitant une pression excessive pour éviter que l’aiguille ne pénètre dans le corps vertébral. Tenez fermement pour exercer une pression sur le corps vertébral et l’aiguille et appuyez sur le piston de la seringue pour expulser le cordon. Transférez immédiatement la moelle épinière dans le tube étiqueté et placez-la dans le bain de glace sèche.
- Répétez la procédure avec tous les animaux jusqu’à ce que la récolte soit terminée. Placez les outils de récolte dans l’éthanol à 70 % entre les animaux. Concentrez-vous sur la cohérence et la vitesse. La durée entre chaque prélèvement d’organe doit rester constante afin de ne pas biaiser les résultats des titres viraux.
- Une fois terminé, désinfectez l’enceinte de sécurité biologique et tout le matériel avant de le retirer de l’animalerie.
- Retirez chaque tube du bain de glace et pesez-les pour déterminer le poids de l’organe. Pour déterminer le poids des organes, soustrayez le poids du tube vide du poids du tube contenant l'organe.
REMARQUE : À ce stade, les organes peuvent être congelés à -80 °C pour un traitement ultérieur ou les organes peuvent être homogénéisés immédiatement avant de congeler des aliquotes individuelles. La congélation et la décongélation des échantillons plusieurs fois diminuent le titre viral. Par conséquent, il est important d’appliquer la même procédure à toutes les expériences d’un même projet.
2. Homogénéisation des organes
- Préparez 3 tubes étiquetés de 1,5 ml à capuchon encliquetable pour chaque organe à homogénéiser.
- Si les échantillons ne sont pas homogénéisés immédiatement après la récolte, retirer les tubes à -80 °C. Les échantillons n’ont pas besoin d’être décongelés pour être homogénéisés.
- Mettez les échantillons sur de la glace pour les garder froids afin de minimiser la perte de titres viraux. Ensuite, ajoutez 1 ml de DMEM froid contenant 5 % de FBS dans chaque tube contenant un organe.
- Battez immédiatement les tubes dans un batteur à billes selon les instructions du fabricant. Homogénéiser tous les organes avec des billes d’acier dans un instrument d’homogénéisation de billes. Assurez-vous que chaque organe a été complètement homogénéisé.
- Faites tourner des débris d’organes dans une microfuge à 12 000 x g pendant 5 min dans une microfuge refroidie à 8 °C. Remettez ensuite les tubes dans le seau à glace. Dans l’enceinte de biosécurité, aliquote des échantillons dans des tubes pour les tests nécessaires. Remettez ensuite les tubes dans le seau à glace.
- Pour le dosage de formation focalisée, aliquote 500 μL dans un tube marqué. Placez ensuite les tubes dans le support sur un seau à glace. Aliquote 50 μL dans un tube d’ARN pour la RT-PCR quantitative fluorogénique (qRT-PCR) afin de mesurer le nombre de copies du génome viral.
- Isolez l’ARN total des organes des animaux infectés à l’aide d’une trousse commerciale d’isolement d’ARN. Déterminez l’ARN viral du flavivirus à l’aide des ensembles d’amorces-sondes spécifiques au virus Zikav, qui reconnaissent des séquences uniques dans chaque génome de flavivirus. Déterminer le nombre de copies virales à l’aide d’un plasmide de contrôle de copie contenant un ARN simple brin positif défini généré in vitro à l’aide de la polymérase T7 contenant les séquences cibles du virus Zika.
- Aliquotez l’échantillon restant, qui est d’environ 300 μL, dans le troisième tube et stockez-le à -80 °C si nécessaire.
REMARQUE : Si les échantillons n’ont pas été congelés auparavant, congeler à -80 °C. Si les échantillons avaient déjà été congelés, passez au test de formation de foyer et/ou à l’isolement de l’ARN avant d’arrêter.
3. Virus Zika - Essai de formation de foyer
REMARQUE : Il est important d’inclure un contrôle sans virus et un contrôle positif. Le témoin positif est une série de dilutions d’un stock de virus dont la concentration est connue. Il n’est pas nécessaire que tous les témoins soient sur la même plaque, mais à mesure que le test dépasse 5 plaques, d’autres témoins doivent être ajoutés et répartis entre les plaques. Veillez à ne pas rayer la monocouche avec les pointes de pipette ou par un lavage vigoureux. Plusieurs organes peuvent être titrés le même jour ou des jours différents. Cependant, un organe individuel ne doit pas être titré sur plusieurs jours, car différentes conditions de dosage peuvent avoir un impact sur le titre viral. Il est fortement recommandé de faire fonctionner un organe individuel en une seule journée.
- Avant le jour de l’essai, préparez les cellules et les réactifs nécessaires à l’essai de formation de foyer.
- Préparez un milieu de culture contenant 500 mL de DMEM avec 5 mL de HEPES et 25 mL de FBS. Avoir des cellules de l’Organisation Véro-Mondiale de la Santé (OMS) qui se développent dans un milieu de croissance à 37 °C, 5 % de CO2 avant le début de l’essai. Les cellules Vero ne doivent pas être à passage élevé ou avoir une croissance supérieure à 100 % de confluence avant le début du test.
- Préparez 500 ml d’une solution de méthylcellulose à 2 % en autocavant une bouteille en verre de 1 L avec 10 g de méthylcellulose et une grande barre d’agitation, et une bouteille en verre séparée de 1 L avec 500 ml de H2O. Si l’eau autoclavée a refroidi, réchauffez-la au micro-ondes jusqu’à ce que la bouteille soit chaude au toucher, mais pas bouillante.
- Versez doucement de l’eau tiède/chaude dans une bouteille de méthylcellulose pendant que vous êtes dans la hotte de culture tissulaire. Fermez partiellement le flacon et remuez sur la plaque chauffante jusqu’à ce que la méthylcellulose soit en solution (1-4 h). Aliquote la solution de méthylcellulose à 2 % dans un tube conique stérile de 50 mL. La méthylcellulose à 2 % peut être stockée à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Préparez une solution de paraformaldéhyde à 5 % dans du PBS pour la fixation des plaques et conservez-la à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Préparez un tampon de lavage de test 1x formant foyer en ajoutant 0,05 % de Triton X-100 au PBS et stocké à RT. Préparez un tampon de coloration 1x FFA en ajoutant 1 mg/mL de saponine au PBS et stocké à 4 °C jusqu’à ce que nécessaire. Ceux-ci peuvent être préparés une à deux semaines à l’avance.
- Calculez le nombre de plaques à fond plat à 96 puits nécessaires pour le test de sorte que chaque organe soit plaqué en trois exemplaires. Prévoyez suffisamment de puits supplémentaires pour les contrôles positifs et négatifs.
- Cultivez suffisamment de cellules Vero dans un milieu de croissance pour terminer le test conçu. Trypsinisez les cellules Vero et comptez-les en les remettant en suspension à 1,5 x 10,5 cellules par mL dans un milieu de croissance. Plaquez les cellules Vero dans les plaques à fond plat de 96 puits à 3,0 x 104 cellules Vero-WHO/puits dans le milieu de croissance en ajoutant 200 μL par puits.
- Incuber les plaques à 37°C à 5 % de CO2 pendant la nuit, assurez-vous que les plaques sont de niveau dans l’incubateur afin que les cellules soient uniformément réparties dans le puits.
REMARQUE : Chaque laboratoire cultive des cellules Vero légèrement différemment ; la cible est une monocouche confluente de 90 à 95 % dans chaque puits le jour de l’essai pour le virus Zika.
- Diluer les échantillons de virus Zika le jour de l’essai. Si les échantillons d’organes avaient déjà été homogénéisés, retirer les échantillons du congélateur à -80 °C et les laisser décongeler avant de les placer sur de la glace pour le dosage.
- Sur la glace, préparez une plaque à fond rond à 96 puits en ajoutant 180 μL de substrat de croissance froide aux rangées B à H, en laissant la rangée A vide. Ajouter 150 μL de chaque échantillon d’organe homogénéisé dans la rangée A de la plaque inférieure ronde.
- Préparez des dilutions 10 fois en série de chaque échantillon, à l’aide d’une pipette multicanaux. Diluez les échantillons dans une plaque à fond rond à 96 puits en ajoutant 20 μL d’échantillon dans 180 μL de milieu de croissance, en changeant les pointes de pipette entre chaque dilution.
- Préparez la plaque de formation de focalisation en retirant le support de la plaque à fond plat à 96 puits recouvrant les cellules Vero. Faites-le immédiatement avant d’ajouter les échantillons de virus pour éviter que la monocouche ne se dessèche.
- Ajouter 100 μL de dilution du virus dans chaque puits de la plaque Vero. Ajoutez un échantillon à l’aide du même ensemble d’embouts en allant de la concentration la plus faible à la concentration la plus élevée. Plaques de roche côte à côte 2 à 4 fois en faisant attention de ne pas tourbillonner.
- Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 à 2 h. Assurez-vous que les plaques sont de niveau dans l’incubateur. Pendant l’incubation, réchauffer 2 % de méthylcellulose à RT.
- Diluer une solution de méthylcellulose à 2 % dans un milieu de croissance. La dilution doit être d’environ 2:1 de méthylcellulose à 2 % de milieu de croissance. Gardez-le à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit temps de l’utiliser. Ajouter 1 à 2 gouttes/puits (régler la pipette à 125 μL) du milieu de croissance méthylcellulose dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
- Incuber 32-40 h à 37 °C, 5 % CO2. Comme les cellules Vero de chacun se développent légèrement différemment, des facteurs tels que la confluence cellulaire et la souche du virus Zika peuvent modifier le temps d'incubation.
- Fixez les cellules Vero à l’aide de la solution préparée de paraformaldéhyde à 5 %.
- Ajouter 50 μL de paraformaldéhyde à 5 % dans chaque puits sur le dessus de la couche de méthylcellulose dans l’enceinte de sécurité biologique. Incuber pendant 60 min à RT. La fixation peut durer toute la nuit à 4 °C mais recouvrir la plaque de parafilm pour réduire l’évaporation.
- Videz le revêtement et le milieu des cellules dans un récipient d’élimination à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Laver délicatement avec du PBS, 150 μL/puits. Retirez le PBS des plaques et retirez la plaque du BSL-2.
- Répétez le lavage PBS 2 fois en ajoutant 150 μL/puits. Retirez ensuite le PBS. Ajouter 150 μL/puits 1x tampon de lavage FFA et laisser reposer pendant 5 à 10 minutes à RT pour perméabiliser les cellules fixes.
- Détecter l’infection à l’aide d’un anticorps primaire contre le virus Zika. Préparez l’anticorps primaire 4G2 (D1-4G2-4-15) à une concentration de 1 μg/mL dans un tampon de coloration FFA. Préparez suffisamment d’anticorps pour l’ensemble du test.
note: Restez à l’écart des couches de laboratoire ou d’autres matériaux absorbants à haute teneur en peluches, car les fibres auront un impact négatif sur l’imagerie des foyers.
- Retirez le tampon de lavage FFA des plaques. Ajouter 50 μL/puits de l’anticorps primaire dans le tampon de coloration FFA. Scellez les plaques avec du parafilm et incubez toute la nuit à 4 °C sur une plate-forme basculante. Le dosage peut être effectué avec une incubation de 2 h à RT.
- Visualisez l’infection avec l’ajout d’un anticorps secondaire conjugué à la HRP. Préparez l’anticorps secondaire de chèvre anti-souris marqué HRP à une concentration de 1:5 000 dans le tampon de coloration FFA. Préparez suffisamment d’anticorps pour l’ensemble du test.
- Lavez les cellules 3 fois avec un tampon de lavage FFA, en retirant le tampon de lavage en le jetant dans l’évier à chaque fois. Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration FFA à 50 μL/puits. Incuber 1-2 h à RT.
- Lavez les cellules 3 fois avec un tampon de lavage FFA, en retirant le tampon de lavage en le jetant dans l’évier à chaque fois. Ajoutez 50 μL/puits de substrat Trueblue.
- Surveillez attentivement les plaques, en attendant 2 à 15 minutes jusqu’à ce que les taches soient complètement définies et que l’arrière-plan soit minimal. Une fois que les taches sont visibles, lavez doucement à l’eau, en utilisant une main pour protéger la monocouche de la force de l’eau qui coule. Séchez sur du papier absorbant (PAS DE COUCHES) et imagez dès que possible.
- Les places peuvent être comptées manuellement ou à l’aide d’un compteur automatisé. S’il est compté manuellement, un oscilloscope de dissection peut être utilisé pour faciliter la visualisation.
- Pour chaque échantillon, choisir une dilution avec des foyers facilement identifiables (p. ex., 20 à 200 par puits) et calculer le titre en unités focalisantes par mL (FFU/ml), en utilisant la moyenne des puits dupliqués : FFU/mL = (foyers/puits moyens) × (facteur de dilution) ÷ (mL inoculum).
