Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Prise de sang et isolement plaquettaire
- Le jour de l’expérience, prélevez du sang humain de donneurs adultes en bonne santé consentants par ponction veineuse dans du citrate trisodique à 3,8 %. Un tube de sang de 4,5 ml suffit pour produire suffisamment de plasma riche en plaquettes (PRP) pour 20-25 affections chez les donneurs dont le nombre de plaquettes est proche de 250 x 103 par μL.
note: Évitez de prélever du sang à l’aide d’aiguilles de calibre étroit (inférieures à 21 g).
- Préparez le PRP par centrifugation à 22 °C et 140 x g pendant 12 min avec un frein long. Il en résultera deux couches distinctes, avec des globules rouges en bas et le PRP de couleur claire en haut.
- Isolez la couche supérieure, trouble et jaune de PRP par un pipetage soigneux à travers une pointe de pipette coupée à un angle de 45° et obtenez la numération plaquettaire via une formule sanguine complète (FSC).
- Si nécessaire, laver les plaquettes dans une solution saline tamponnée au sel sodique de l'acide 1,4-Pipérazinediéténèsulfonique (PIPES) (150 mM de chlorure de sodium, NaCl, 20 mM de PIPE) en présence de prostaglandine E1 (PGE1), et les remettre en suspension dans le tampon de Tyrode (134 mM de NaCl, 0,34 mM d'hydrogénophosphate disodique, Na2HPO4, 2,9 mM de chlorure de potassium, KCl, 1 mM de chlorure de magnésium, MgCl2, 5 mM de glucose, 12 mM de bicarbonate de sodium, NaHCO3, 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique, HEPES, pH 7,35) avec 5 mM de glucose, sinon, passez à l’étape 1.5. Les étapes suivantes décrivent brièvement le lavage.
- Ajuster le volume de PRP à 10 mL avec une solution saline tamponnée par des PIPES et ajouter 0,6 μM de PGE1.
- Centrifugez pendant 8 min à 1 900 x g, puis jetez le surnageant et laissez reposer la pastille de plaquettes dans 400 μL de solution de Tyrode et de glucose pendant 5 min.
- Remettez doucement la pastille de plaquettes en suspension et conservez-la sans la déranger pendant 30 min.
- Ajustez la numération plaquettaire à ~250 x 103 plaquettes par μL avec du plasma humain pauvre en plaquettes (PPP) et maintenez la suspension à 22 °C sans être dérangée ou sous une rotation douce.
2. Traitement par anticorps et cisaillement uniforme
REMARQUE : Toutes les étapes de la section 2 qui nécessitent un pipetage doivent être effectuées lentement, afin de ne pas introduire de cisaillement.
- Ajoutez l’anticorps souhaité au PRP ou aux plaquettes lavées et mélangez doucement en pipetant de haut en bas ou en remuant avec une pointe de pipette. Laissez-le tranquille à température ambiante pendant 5 à 10 min. Ajouter un volume équivalent de tampon PPP ou de tampon de Tyrode à un témoin négatif.
- Allumez le viscosimètre à plaque conique, réglez la température de la plaque sur 22 °C et laissez le temps à la plaque d’atteindre cette température.
- Pipetez le PRP traité ou les plaquettes lavées sur le viscosimètre à plaque conique à température contrôlée directement au centre de la plaque. Assurez-vous que tout l'échantillon est déposé entre le cône et la plaque au point de contact, et non à l'extérieur du bord du cône.
- Cisaillement à une vitesse et une durée appropriées.
- Calculez le cisaillement comme indiqué par le manuel du viscosimètre, ou comme indiqué précédemment.
- Déterminer le taux de cisaillement à partir de la viscosité et la contrainte de cisaillement souhaitée via la loi de la viscosité de Newton ;
3. Détection de marqueurs de surface et réticulation par cytométrie en flux
- Analysez l’échantillon par cytométrie en flux, en recueillant au moins 20 000 événements pour chaque condition.
- Quantifiez l’intensité du signal des marqueurs fluorescents à l’aide de la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore, ou de l’intensité de fluorescence moyenne géométrique (MFI).
- Si vous souhaitez détecter la réticulation plaquettaire après un traitement par cisaillement, analysez l’échantillon sur un cytomètre en flux capable d’imagerie et quantifiez la réticulation par des paramètres de surface et d’aspect.
- Tracez un histogramme de la surface et/ou du rapport hauteur/ou hauteur.
- Utilisez un contrôle négatif avec de l’albumine sérique bovine (BSA) ou un véhicule pour dessiner une porte excluant la plupart des événements entièrement circulaires (cette porte est généralement dessinée à un rapport d’aspect ~0,8) et quantifier le pourcentage d’événements à l’intérieur de cette porte. Les événements dont le rapport hauteur/largeur est inférieur sont plus susceptibles d’être liés entre eux.
