Évaluation du potentiel antimicrobien des isolats bactériocines fécaux murins producteurs de bactériocine

Résumé

Source : Bäuerl, C., et al. Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiote intestinal des souris. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo démontre la détection de bactéries lactiques productrices de bactériocine dérivées de matières fécales de souris. Le test détermine l’activité antimicrobienne de la bactériocine sur des souches bactériennes spécifiques.

Protocole

1. Comptage des LAB et activité de la bactériocine

1. Peser une pastille fécale de chaque échantillon dans un tube de 1,5 mL et ajouter un volume adéquat de NaCl glacé à 0,9 % pour obtenir une solution à 10 % (p/v). Utilisez des micropilons stériles pour des tubes de 1,5 mL afin d’homogénéiser la suspension fécale et de préparer des dilutions en série de dix fois dans du NaCl froid à 0,9 %.
2. Comptez le nombre total de cellules LAB.
   1. Transférez les cellules diluées (100 μL) dans 4 mL de gélose molle Man Rogosa Sharpe (MRS) préchauffée (50 °C, 0,8 % de gélose). Mélanger par vortex avant de verser les cellules sur une plaque de gélose MRS solide (1,5 % d’agar).
   2. Séchez la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 minutes dans le capot stérile avant d’incuber les cellules pendant 20 à 24 h à 30 °C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.
3. Compter les cellules productrices de bactériocine.
   1. Transvaser les cellules diluées (100 μL) du producteur de bactériocine dans 4 mL de gélose molle MRS préchauffée (50 °C, 0,8 % de gélose), mélanger par vortex et verser les cellules sur une plaque de gélose MRS (1,5 % de gélose) ; cette couche est appelée première couche.
   2. Transférez 4 mL supplémentaires de gélose molle MRS sans cellules (gélose à 0,8 %) sur la première couche pour intégrer toutes les cellules dans la gélose molle.
      note: Cette couche est destinée à empêcher les cellules de se développer en colonies à la surface des plaques de gélose. Les cellules qui se développent à la surface sont facilement déplacées lors du versement des cellules indicatrices sur le dessus (étape 4.3.4) et compliquent donc l’interprétation des résultats. Cette couche est appelée la deuxième couche.
   3. Séchez la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 minutes dans le capot stérile avant de l’incuber pendant 20 à 24 h à 30 °C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.
   4. Pour identifier les colonies productrices de bactériocine, mélanger 40 μL d’une culture de nuit d’une souche indicatrice appropriée, avec 4 mL de gélose molle préchauffée. Versez le mélange sur l’assiette ; Cette couche est appelée la troisième couche.
   5. Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans la hotte stérile avant de l’incuber pendant 20 à 24 h à 30 °C pour la croissance cellulaire et la formation des colonies.
      note: Les colonies productrices de bactériocine ont des zones claires (inhibition) autour des colonies (figure 1).

Résultats

Figure 1 : Détection de la production de bactériocine dans les bactéries lactiques récupérées à partir des matières fécales par un protocole à trois couches (tel que décrit dans la procédure)

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri en plastique	Thermo Scientific	101VR20
Bouillon d’infusion cerveau-cœur	Conda	1400
Gélose bactériologique européenne	Pronadisa	1800
Agarose D1 à faible EEO	Pronadisa	Référence 8010
1x tampon TAE	Thermo Scientific	15558042
Bouillon MRS	Difco	Référence 288130
Comprimés PBS	sigma	P4417-100TAB
écaille	Mettler Toledo	PB602-S