1. Placage des BMM sur des lamelles pour l’infection
- Préparez des plaques de culture tissulaire à 6 puits en plaçant quatre (4) lamelles en verre stériles de 12 mm (autoclavées et stockées dans un récipient en verre fermé) au fond de chaque puits vide.
note: Prélever chaque lamelle stérile de 12 mm à l’aide d’une pointe d’aspiration montée sur une conduite de vide. Placez les lamelles dans les puits sans chevauchement, en les libérant à la position souhaitée en pinçant le tube pour interrompre le vide.
- Aspirez les milieux (et toutes les cellules non adhérentes) des boîtes de Pétri recouvertes de macrophages adhérents dérivés de la moelle osseuse et rincez doucement les cellules adhérentes 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile sans chlorure de calcium et de magnésium (PBS -/-) préchauffée à 37 °C.
- Ajouter goutte à goutte 5 mL stériles 1x PBS -/- avec une concentration finale de 1 mM d’EDTA dans chaque boîte de Pétri et incuber pendant 5 min à 37 °C pour détacher les BMM adhérents. Vérifier que les cellules sont détachées à l’aide d’un microscope.
- Prélever toutes les cellules détachées en suspension dans 1x PBS -/- complété par 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube conique de 50 mL. Rincez chaque plat 2 fois avec 5 ml de PBS -/- et ajoutez-le à la réserve de suspension cellulaire.
note: La suspension cellulaire peut être diluée avec du PBS supplémentaire -/- pour protéger les macrophages de la toxicité de l’EDTA pendant le processus de collecte.
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les macrophages en suspension dans 5 à 10 mL de milieu BMM par pipetage. Placez les cellules remises en suspension sur de la glace pour éviter qu’elles ne se fixent aux tubes et ne s’agglutinent.
- Compter les cellules viables à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan dans l’hémocytomètre.
note: Pour compter les cellules BMM remises en suspension dans un milieu de 5 mL, un mélange de dilution de 25 μL de suspension cellulaire dans 445 μL de PBS -/- et de 30 μL de solution de bleu de trypan à 0,4 % permet généralement une quantification facile dans un hémocytomètre (en tenant compte d’un facteur de dilution de 20x pour le calcul final). Ne comptez que les cellules qui n’ont pas été colorées au bleu de trypan (cellules viables). Le volume de la suspension cellulaire peut être modifié si ce mélange est trop concentré ou dilué. En général, le rendement en BMM par préparation varie entre 2 x 107 et 5 x 107 cellules d’une seule souris.
- Préparez la suspension cellulaire dans un milieu BMM à la concentration de placage souhaitée (5 x 105/mL) et dispersez la suspension dans des plaques à 6 puits dans un milieu de 2 mL par puits de sorte que chaque puits reçoive 1 x 106 macrophages.
note: Il s’agit d’une étape essentielle qui permet de s’assurer que chaque puits reçoit le nombre adéquat de macrophages pour couvrir uniformément les lamelles. Vérifiez que les lamelles dans les puits ne se chevauchent pas ou ne flottent pas dans le fluide. Si c’est le cas, ajustez doucement à l’aide d’une pointe de pipette stérile.
- Incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % CO2.
2. Purification des formes infectieuses de L. amazonensis
REMARQUE : Préparer Leishmania pour les infections - purifier les promastigotes métacycliques des cultures stationnaires de promastigotes ou différencier les promastigotes en culture en forme d’amastigote à l’aide du protocole de différenciation axénique standard de L. amazonensis.
- Purification de promastigotes métacycliques de Leishmania à l’aide de milieux à gradient de densité (Matériaux)
- Préparez une solution mère à 40 % de milieux à gradient de densité dans de l’eau stérile sans endotoxines.
- Diluer la solution de gradient de densité dans 10x milieu M199 (sans sérum) pour préparer une concentration de 10 % dans le milieu M199.
- Filtrez toutes les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
note: Les solutions mères peuvent être conservées à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 mois au maximum.
- Ajouter 2 mL de solution de média à gradient de densité de 40 % dans le fond d’un tube à centrifuger conique de 15 mL.
- Déposer soigneusement une couche de 2 mL de solution de milieu à gradient de densité de 10 % dans M199 par-dessus la couche de milieu à gradient de densité de 40 %, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter tout mélange entre les deux couches.
- Prélever 1 x 109 parasites d’une culture en phase stationnaire par centrifugation à 1 900 x g pendant 10 min.
- Remettre les cellules en suspension dans 6 mL de milieu essentiel modifié (DMEM) de Dulbecco.
- Déposer 2 mL de suspension cellulaire directement sur la couche de milieu à gradient de densité de 10 %, doucement, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter de mélanger les couches.
- Centrifuger le gradient pendant 10 min à 1 300 x g à température ambiante.
note: En raison des différences de propriétés physiques entre les espèces de Leishmania, les conditions de centrifugation de chacune d’entre elles peuvent devoir être légèrement ajustées pour assurer un rendement maximal.
- Prélever les parasites (enrichis sous forme de promastigote métacyclique) à partir de la bande formée à la limite supérieure du milieu du gradient de densité de 10 % (interface entre les couches de milieu du gradient de densité de 0 % et de 10 %).
- Diluer les parasites avec un volume de DMEM et recueillir par centrifugation (1 900 x g pendant 10 min à température ambiante).
- Remettre en suspension dans un milieu DMEM de 500 μL et compter dans un hémocytomètre pour quantifier le rendement.
- Génération d’amastigotes de L. amazonensis dans des conditions d’élevage axéniques (pH bas / température élevée).
- Mélanger 5 mL de culture de promastigote en phase logarithmique (pH de 7,4 à 26 °C) avec un volume égal de milieu d’amastigote (pH de 4,5), à l’aide de25 flacons de 25 cm (milieu total de 10 ml) et incuber à 26 °C pendant la nuit.
- Déplacez la fiole de 26 °C à 32 °C.
- Après 3 ou 4 jours, culture fractionnée 1:5 dans un milieu amastigote à 32 °C.
- Vérifiez les parasites dans les 3 à 4 prochains jours (maximum 7 jours) pour voir s’ils sont prêts à être utilisés contre les infections.
note: Les amastigotes axéniques sains doivent avoir une forme ovale, sans flagelles visibles. Les amastigotes partiellement différenciés ont une grande forme ovale avec des flagelles courts. La culture ne doit pas avoir beaucoup de touffes - de nombreuses touffes sont une indication de parasites non en croissance et mourants. La culture de l’amastigote peut être divisée à l’échelle 1:5 et maintenue pendant un maximum de 3 semaines.
3. Infection par L. amazonensis
- Diluer les suspensions parasitaires selon le MOI souhaité (généralement 3 à 5 promastigotes métacycliques par macrophage [MOI de 1:3 ou 1:5] et 1 amastigote par macrophage [MOI 1:1]). Ajouter Leishmania dans du PBS -/- dans un volume de 50 à 100 μL dans chaque puits contenant déjà 2 mL de milieu.
- Incuber des BMM pendant 1 h avec des amastigotes et 3 h avec des promastigotes métacycliques à 34 oC pour l’infection.
note: La température optimale de l’infection peut varier selon l’espèce.
- Après l’incubation, éliminer soigneusement les parasites libres dans chaque puits 3 fois avec 2 mL de PBS -/- préchauffé à 37 °C
note: Dispersez doucement le PBS pour vous assurer que les lamelles ne flottent pas les unes sur les autres. Agitez doucement l’assiette, puis aspirez le liquide. Utilisez des embouts d’aspiration séparés si vous utilisez plusieurs souches de parasites pour éviter la contamination croisée.
- Fixez des échantillons ponctuels de 1 h ou 3 h en incubant chaque puits avec 1,5 à 2 mL de PFA à 2 % dans du PBS -/- pendant 10 min. Laver 3 fois avec du PBS -/-. Ne pas aspirer les plaques de lavage et de réfrigération contenant des lamelles dans du PBS jusqu’à ce qu’elles soient tachées.
- Ajouter 2 ml de milieu BMM frais dans chaque puits sur des assiettes pour plus de points temporels et incuber à 34 °C.
- Fixez les points de temps restants comme vous le souhaitez, comme décrit à l’étape 4.3, et réfrigérez les plaques jusqu’à ce qu’elles colorent.
4. Coloration DAPI et montage de lamelles
- Aspirez le PBS des puits contenant des lamelles et ajoutez 1,5 mL de PBS -/- avec 0,1 % de détergent non ionique. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de 3 lavages avec 2 mL de PBS -/-.
- Ajouter 1 mL de PBS -/- avec 2 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilué à partir d’une solution mère de 5 mg/mL dans de l’eau) dans des puits contenant des lamelles et incuber pendant 1 h à température ambiante.
note: Le temps d’incubation avec le DAPI est critique pour une bonne visualisation des parasites intracellulaires de Leishmania. Les noyaux des macrophages se colorent rapidement, en raison de leur taille plus grande et de leur contenu en ADN, mais la coloration des noyaux des parasites intracellulaires est plus lente. Ainsi, il est nécessaire d’allonger le temps d’incubation au-delà de ce qui est nécessaire pour visualiser les noyaux BMM afin de permettre au DAPI de pénétrer à travers la membrane plasmique du parasite et la membrane nucléaire du parasite. Avec une coloration DAPI appropriée, l’ADN du kinétoplaste mitochondrial près de la poche flagellaire du parasite peut également être visualisé, en plus de l’ADN nucléaire.
- Lavez chaque puits contenant des lamelles 3x avec 2 mL de PBS -/-, puis soulevez et retournez les lamelles avec une pince pour placer la face cellulaire vers le bas et fixez-les sur des lames de microscope en verre avec un réactif de montage anti-décoloration disponible dans le commerce.
note: Les lamelles sont extrêmement fragiles et nécessitent une manipulation prudente. Évitez d’exercer une pression sur eux, en particulier contre la paroi latérale des puits lors du levage. L’ajout de quelques gouttes de PBS -/- réduit la tension superficielle entre la lamelle de recouvrement et le puits et facilite le processus de levage. Une aiguille fine peut être utilisée pour aider à soulever les lamelles du fond du puits. Après avoir placé une lamelle sur la glissière, appuyez doucement avec une pince pour expulser les bulles d’air dans le support de montage. Si une lamelle est cassée ou s’est peut-être retournée pendant le processus de levage, ne remontez pas ; Il suffit d’utiliser la quatrième lamelle de rechange.
- Réfrigérer les lames jusqu’à quantification.
5. Quantification de l’infection
- Examinez des lames colorées au DAPI au microscope à fluorescence en faisant la mise au point sur les macrophages à l’aide d’une lentille d’objectif 100X avec de l’huile d’immersion (excitation à 358 nm ; émission optimale à 461 nm).
Assurez-vous que l’accent est mis sur la couche de macrophages entre la lame de verre et la lamelle.
- Quantifier le nombre de macrophages (gros noyaux colorés au DAPI) et le nombre de petits noyaux d’amastigote regroupés autour de chaque noyau de macrophage (voir Figure 1A, DAPI) pour chaque champ de vision, à l’aide d’un compteur manuel><.
note: Les noyaux d’amastigote peuvent ne pas être tous visibles dans un seul plan de foyer en raison de leur petite taille. Comptez ceux qui sont visibles lorsqu’ils sont focalisés sur les noyaux de macrophages, puis utilisez la mise au point fine pour vérifier la présence de noyaux de parasites dans les plans au-dessus et en dessous des noyaux de macrophages.
- Déplacez-vous vers un autre champ de vision pour répéter la quantification. Utilisez une touche de compteur distincte pour suivre le nombre de champs comptés. Déplacez-vous dans les champs visuels en rangées parallèles sur chaque lamelle, afin d’éviter le chevauchement des comptages.
- Quantifier un minimum de 200 macrophages par lamelle. Quantifier chaque point temporel de l’infection en trois exemplaires (3 lamelles). Comptez la quatrième lamelle si l’une des précédentes ne convient pas au comptage en raison d’un chevauchement de lamelle, d’un mauvais montage, d’un bris de verre, etc.
note: Si 200 macrophages ne peuvent pas être comptés sur une seule lamelle, comptez le quatrième de rechange.
- Calculez les taux d’infection en amastigotes/macrophages ou amastigotes/100 macrophages et déterminez le pourcentage de macrophages infectés à partir des données de quantification brutes.
