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1. Préparation des bactéries
REMARQUE : Les substrats bactériens à cellules entières et les peptidoglycanes purifiés sont utilisés comme substrats enzymatiques dans l’essai de diffusion sur microlames et dans l’essai de libération de colorants. Ces substrats nécessitent une préparation avant de mener les réactions enzymatiques. Le protocole suivant décrit leur préparation.
- Substrat de cellule bactérienne entière
- Produire un substrat cellulaire bactérien en inoculant 500 ml de bouillon nutritif avec une culture de nuit de 2 ml de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection ; ATCC 23857). Incuber à 30 °C en agitant (125 tr/min) jusqu’à ce que la culture atteigne une phase de croissance exponentielle, définie comme une phase de croissance rapide entraînant le doublement de la culture bactérienne. Pour la culture de Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), utiliser un bouillon nutritif comme milieu de croissance à 37 °C en agitant (125 tr/min).
- Tuer chaque culture par autoclave pendant 10 min à 121 °C sous une pression de 3 atm.
- Récoltez le substrat bactérien tué par la chaleur par centrifugation pendant 20 min à 5 000 x g. Lavez le granulé trois fois avec de l’eau de type 1 et mettez-le en suspension dans une quantité minimale d’eau. Dans cette étude, suspendre les substrats dans 1 200 μl.
- Aliquote 300 μl des substrats cellulaires bactériens dans des tubes microfuges de 1,5 ml et stockage à 20 °C.
2. Étiquetage du substrat - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling
REMARQUE : Dans le test de libération de colorant, le substrat est lié de manière covalente au colorant R bleu brillant Remazol. Le protocole suivant décrit la préparation de substrats enzymatiques teintés.
- Préparez une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) de 250 mM en dissolvant 1 g de NaOH dans 99 ml d’eau de type I à utiliser pour fabriquer une solution de colorant R bleu brillant (RBB) de 200 mM de Remazol.
- Préparez une solution de 200 mM de RBB en dissolvant 1,25 g de RBB dans 98,75 ml ± 1 ml d’une solution fraîche de 250 mM de NaOH.
- Remettre en suspension les cellules bactériennes tuées par la chaleur à une concentration de 0,5 g de poids humide dans 30 ml de solution de RBB. Pour le peptidoglycane purifié, remettre le peptidoglycane en suspension à une concentration de 0,3 g de poids humide dans 30 ml de solution de RBB.
- Incuber le mélange réactionnel dans un erlenmeyer sur une plate-forme rotative pendant 6 h à 37 °C avec un mélange doux.
- Transférez le mélange réactionnel dans un incubateur à 4 °C et incubez pendant 12 heures supplémentaires en mélangeant doucement.
- Après l’incubation, récoltez le substrat teint par centrifugation à 3 000 x g pendant 30 min. Décantez la solution de colorant de la pastille de substrat
.
- Éliminer le colorant soluble lié de manière non covalente des substrats en lavant les cellules marquées au colorant ou le peptidoglycane à plusieurs reprises (environ 3 à 5 lavages) avec de l’eau de type I suivie d’une centrifugation. À chaque ajout d’eau, remettez soigneusement le granulé en suspension.
note: Lorsqu’il n’est pas lié, le colorant soluble n’est plus visible dans le lavage à l’eau après la centrifugation. Le substrat doit être lavé une fois de plus. Notez que le substrat restera bleu, tandis que le surnageant du dernier lavage sera clair.
- Stockez les substrats teints en suspension dans une quantité minimale d’eau à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
3. Dosage quantitatif de libération de colorant
REMARQUE : Pendant l’essai de libération de colorant, l’hydrolyse du substrat teinté RBB dans la réaction enzymatique libère des produits colorés dans le surnageant de réaction. La mesure colorimétrique de la quantité de colorant libérée indique la quantité d’activité enzymatique présente dans l’échantillon pour une enzyme donnée. La méthode quantitative permet de comparer différentes enzymes à travers les substrats et permet de varier les conditions environnementales influençant la réaction enzymatique (par exemple, la température, la salinité et le pH). Le protocole suivant décrit la préparation et le rendement de l’essai de libération de colorants pour la détection quantitative de l’activité enzymatique des antimicrobiens protéiques.
- Préparation pour le dosage de libération de colorant
- Laisser le substrat teint congelé revenir à température ambiante et laver deux fois avec un tampon de dosage (solution saline tamponnée au phosphate, PBS), qui est déterminé empiriquement pour l’enzyme donnée.
- Calculez le volume de suspension de substrat nécessaire en multipliant le volume de réaction de 200 μl par le nombre de tests de libération de colorant à effectuer.
- Préparer la suspension du substrat en ajoutant du substrat teint au volume de tampon de dosage, déterminé en 4.1.2, jusqu’à ce qu’une densité optique (DO) de 2,0 soit atteinte à 595 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour rester dans les limites fonctionnelles du spectrophotomètre, mesurer la DO595 de 2,0 à 1,0 pour une dilution de 1:1 de la solution concentrée. Utiliser le tampon de test en tant que blank.
note: La turbidité du substrat pour la réaction peut être augmentée au-delà de 2,0 pour correspondre aux niveaux d’activité des enzymes très efficaces.
- Mettre en suspension la protéine antimicrobienne à évaluer dans le tampon d’essai à une concentration estimée de 1 mg/ml.
- À l'aide du dosage sur microplaque d'un kit de dosage des protéines d'acide bicchoninique (BCA) conformément au protocole du fabricant, déterminez la concentration réelle de l'échantillon de protéines à analyser. Ajuster la concentration de la suspension mère à 1 mg/ml à l’aide d’un tampon de dosage.
- Utilisation du test de libération de colorant pour déterminer les conditions d’incubation optimales d’une protéine antimicrobienne
- Diluer la suspension antimicrobienne protéique à 100 ng/μl. Cette concentration donne une masse réactionnelle finale de 1 μg de protéine par volume (10 μl) ajoutée à la réaction de dosage.
- Déterminer la plage thermique à évaluer pour la protéine bactériolytique. La plage thermique de ces tests comprenait 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C et 65 °C.
- Effectuez les tests de réaction dans des tubes microfuges de 0,5 ml. Pour chaque condition thermique, ajouter 10 μl de la protéine mère à 200 μl de suspension de substrat préparée.
- Incuber dans un thermocycleur pendant 8 heures avec mélange par inversion une fois par heure.
- Après l’incubation, arrêtez les réactions en ajoutant 25 μl d’éthanol.
- Retirer le substrat non digéré et insoluble par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min, et transférer 150 μl du surnageant de réaction pour chaque mélange réactionnel dans une microplaque à fond plat de 96 puits, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de substrat non digéré.
- Mesurez l’activité enzymatique de la protéine antimicrobienne pour le substrat donné en déterminant la quantité de colorant RBB soluble dissociée du substrat après hydrolyse enzymatique. Pour quantifier l’activité enzymatique, mesurer l’absorbance du surnageant à 595 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. L’augmentation de l’absorbance par le colorant soluble libéré dans le surnageant à partir du substrat marqué est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.
note: La variation de l’absorbance est représentée par les unités d’activité (UA), où 1 UA entraîne une augmentation de 0,01 de la densité optique du surnageant de la réaction de libération de colorant à 595 nm. Une réaction à blanc, incubée avec tous les composants de la réaction à l’exception de l’enzyme, est utilisée pour soustraire tout colorant libéré du substrat marqué RBB en raison de l’incubation. La température enzymatique optimale fournit la mesure de l’unité d’activité maximale.