Dosage sur plaque ponctuelle pour l’évaluation des réponses au stress oxydatif dans des souches bactériennes

Résumé

Source : Ketelboeter, L. M. et al., Méthodes pour inhiber la production bactérienne de pyomélanine et déterminer l’augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo présente un test sur plaque ponctuelle conçu pour évaluer les réponses au stress oxydatif des souches bactériennes. Certaines souches produisent de la pyomélanine, un pigment antioxydant. À l’inverse, les souches traitées avec un agent d’essai, entraînant une réduction de la production de pyomélanine, présentent une sensibilité accrue au stress oxydatif, ce qui entraîne une diminution de la viabilité cellulaire par rapport aux souches productrices de pyomélanine.

Protocole

1. Préparation des milieux de culture, des antibiotiques et du 2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)

1. Préparez le bouillon Luria-Bertani (LB) (1 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 0,25 % de chlorure de sodium, NaCl dans H₂O) et aliquote dans les volumes appropriés. Stériliser par autoclave. Conserver à température ambiante.
2. Préparer 100 ml de gélose LB (1 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 0,25 % de NaCl, 1,5 % de gélose en H₂O) dans des flacons de 250 ml. Stériliser en autoclave et conserver à température ambiante. Assurez-vous que la gélose est fondue avant de la verser dans les assiettes.
   note: Les flacons contenant 100 ml de gélose LB donneront 4 plaques. La quantité de gélose LB peut être modifiée pour correspondre au nombre de plaques nécessaires pour le dosage.
3. Fabriquer une solution saline tamponnée au phosphate, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM chlorure de potassium, KCl, 10 mM d’hydrogénophosphate disodique, Na₂HPO₄, 2 mM de dihydrogénophosphate de potassium, KH₂PO₄). Stériliser en autoclave ou par filtration et conserver à température ambiante.
4. Préparez les solutions mères d’antibiotiques pour la gentamicine, la kanamycine et la tobramycine.
   1. Préparer des concentrations d’antibiotiques appropriées pour les souches de Pseudomonas aeruginosa contenant 100 mg/ml de gentamicine, 30 mg/ml de kanamycine et 10 mg/ml de tobramycine. Dissoudre les antibiotiques dans l’eau, filtrer la stérilisation (0,2 μm) et les conserver à 4 °C. Modifier les antibiotiques et les concentrations en fonction de la bactérie étudiée.

2. Dosage sur plaque ponctuelle pour la réponse au stress oxydatif

1. Mettez en place des cultures nocturnes des souches à tester. Ajouter 2 ml de bouillon LB dans des tubes à essai de 16 x 150 mm (un par souche) et inoculer avec 1 colonie isolée de chaque souche. Incuber toute la nuit à 37 °C avec aération sur un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air.
2. Mesurez la DO₆₀₀ des cultures de nuit. Laver les cultures avant de prendre des lectures de DO₆₀₀ pour éliminer la pyomélanine présente dans le milieu.
3. Lavez les cultures en centrifugeant 1 ml de culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 x g pendant 2 min. Retirez le surnageant et toutes les cellules légèrement granulées à l’aide d’un micro-pipeteur, puis remettez en suspension la pastille de cellules solides dans 1 ml de lb.
4. Le lendemain, préparez des plaques de gélose LB contenant H₂O₂ comme facteur de stress oxydatif. Une gamme de concentrations en H₂O₂ de 0 à 1 mM est un bon point de départ.
   1. Faites fondre les flacons de gélose LB. Refroidir le milieu à environ 50 °C à température ambiante.
   2. Ajoutez du H₂O₂ directement dans le milieu refroidi aux concentrations souhaitées. Agiter les flacons pour mélanger. Voir le tableau 1 pour les concentrations de H₂O₂ et les volumes de H₂O₂ concentré à ajouter. Ces valeurs sont basées sur 100 ml de gélose LB.
   3. Versez les assiettes immédiatement après avoir ajouté H₂O₂ et flammez la surface pour éliminer les bulles. Le rendement est de 4 plaques pour 100 ml de gélose LB. Marquez les plaques avec la concentration H₂O₂.
   4. Placez les plaques découvertes dans une hotte à flux biologique avec le ventilateur en marche pendant 30 min pour éliminer l’excès d’humidité des plaques.
      note: Utilisez les assiettes le jour même de leur préparation. Le non-respect de cette consigne peut entraîner des données incohérentes.
      note: Des facteurs de stress oxydatifs tels que le paraquat peuvent être substitués à_H2O₂ dans ce test. Les concentrations utilisées pour d’autres facteurs de stress oxydatif peuvent être différentes de celles utilisées pour_H2O₂.
5. Lavez et mesurez la DO₆₀₀ des cultures de nuit.
6. Normaliser la DO₆₀₀ de toutes les cultures de nuit à la valeur la plus basse pour l’ensemble des souches testées. P. aeruginosa a généralement une DO₆₀₀ d’environ 2,5 lorsqu’elle est cultivée pendant la nuit dans la LB.
   1. Déterminer le volume de culture nécessaire pour diluer la culture à la DO la plus faible_{de 600} dans un volume total de 1 ml. Par exemple, si une culture a une DO₆₀₀ de 3 et que la DO₆₀₀ la plus basse pour l’ensemble des souches est de 2,5, effectuez le calcul suivant : (2,5)(1 ml) = (3)(x). x = 0,833 ml. 0,833 ml de culture sera placé dans un tube à microfuge.
   2. Calculez la quantité de LB + DMSO nécessaire pour porter le volume de culture à 1 ml. Pour l’exemple de l’étape 4.4.1, la quantité de LB + DMSO ajoutée à la culture serait de 0,167 ml (volume total de 1 ml – 0,833 ml de culture). Préparez des solutions mères de LB + DMSO à utiliser pour ces dilutions en fonction du volume nécessaire pour diluer toutes les souches.
   3. Mélanger la culture et LB+DMSO par vortexing.
7. Pour maintenir les cultures dans une concentration constante de DMSO, effectuez des dilutions en série décuplées des cultures de nuit normalisées dans PBS + DMSO.
   1. Préparez une solution mère de PBS + DMSO. Pour une série de dilutions pour une souche, mélanger un volume de 300 μM de DMSO avec du PBS pour obtenir un volume total de 720 μl. Augmentez ou réduisez ces stocks en fonction du nombre de souches testées.
   2. Étiquetez les tubes microfuges pour les dilutions en série de ^10-1 à ^10-7. Ajoutez 90 μl de PBS + DMSO dans les tubes appropriés. Utilisez PBS + DMSO pour les souches cultivées en LB + DMSO.
   3. Ajouter 10 μl de culture dans le tube de dilution ^10-1 approprié. Mélanger par vortex et transférer 10 μl de la dilution ^10-1 dans le tube de dilution ^10-2. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été effectuées. Changez les pointes de pipette entre les dilutions.
8. Repérer 5 μl des dilutions ^10-3 à ^10-7 sur des plaques LB + H₂O₂ en double pour chaque déformation. Utilisez une pointe de pipette si les points sont plaqués du plus dilué au moins dilué (^10-7 à ^10-3). Ne renversez pas ou n’inclinez pas la plaque tant que le liquide n’a pas séché dans la plaque.
9. Incuber les plaques pendant 24 à 48 heures à 37 °C (incubateur d’air), selon la souche.
   REMARQUE : P. aeruginosa PAO1 aura des colonies de bonne taille sur LB après 24 heures d’incubation. Incuber les souches jusqu’à ce qu’elles aient des colonies à peu près de la même taille que PAO1.
10. Photographiez les plaques à l’aide d’une caméra CCD au-dessus d’un transluminateur. Si vous le souhaitez, modifiez les photos pour les contraster et recadrez-les à la même taille. Comptez le nombre de colonies à chaque endroit pour déterminer les changements de sensibilité au stress oxydatif.

Tableau 1 : Concentrations de H₂O₂ à ajouter à la gélose LB pour l’essai sur plaque ponctuelle de stress oxydatif. Ce tableau donne les différentes concentrations de H₂O₂ et la quantité correspondante de stock concentré de H₂O₂ à ajouter à 100 ml de gélose LB.

Concentration finale de H2O2 (mM)	Quantité de 9,79 M H2O2 (30 % poids) à ajouter (μl)
0	0
0,2	2,04
0,4	4.09
0,6	6.13
0,8	8.17
1	10.21

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269 à 50 mg	Aussi appelé nitisinone. Soluble dans le DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	Référence 216763-100ML	30 % en poids de H2O. Stabilisé.