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1. Souche bactérienne et milieu de croissance
- Préparez de l’albumine dextrose et une solution mère de sel (ADS) en solubilisant 25 g d’albumine sérique bovine, 10,0 g de dextrose et 4,05 g de chlorure de sodium dans 460 ml d’eau désionisée. Stérilisez l’ADS par filtre et rangez-le à 4 °C.
- Préparez le bouillon 7H9 en ajoutant 4,7 g de poudre 7H9 et 2 ml de glycérol à 900 ml d’eau purifiée. Autoclavez le bouillon 7H9 à 121 °C pendant 10 min et laissez-le refroidir à température ambiante avant de continuer. Préparez du 7H9ADST en ajoutant 100 ml d’ADS et 0,5 mL de Tween80 à 900 mL de bouillon 7H9. Conserver à 4 °C.
- Peser 50 mg de sulfate de kanamycine et le dissoudre dans 1 mL d’eau désionisée ; la concentration finale est de 50 mg/mL. Filtrer-stériliser et conserver à -20 °C. Ajouter 0,5 mL de solution mère de kanamycine pour 1 L de 7H9ADST.
note: Ce milieu doit être frais, alors adaptez les volumes de manière appropriée en fonction de la taille de la culture.
- Cultiver M. tuberculosis dans 7H9ADST complété par de la kanamycine en culture sur pied. Agitez la culture quotidiennement et diluez-la avant que la DO600 n’atteigne 1,0 pour éviter l’agglutination.
note: La souche de M. tuberculosis utilisée pour le développement de cette méthode était H37Rv transformée avec le plasmide pJAK2.A. pJAK2.A est un plasmide intégratif basé sur le vecteur pMV361, qui permet l’expression de haut niveau du gène de la luciférase de la luciole à partir du promoteur hsp60 et peut être sélectionné à l’aide de la kanamycine.
2. Analyse de l’activité dans le bouillon à l’aide d’un test de resazurine
- Cultiver M. tuberculosis en 7H9ADST jusqu’à la phase mi-log (~ 0,5 - 0,8 OD600). Diluer la culture avec le 7H9ADST à 0,01 OD600. Diluer les composés dans 7H9ADST jusqu’à 2 fois les concentrations d’essai et aliquote 100 μL de chaque composé dilué dans chaque puits.
- Transvaser 100 μL de la suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Laissez les plaques incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 5 jours. Dissoudre 10 mg de résazurine dans 100 mL d’eau déminéralisée et un filtre stérile.
- Ajouter 30 μL de solution de résazurine et surveiller le changement de couleur après 48 h ; la croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose.
note: Une analyse quantitative peut également être effectuée en mesurant soit la fluorescence à 590 nm avec excitation à 530 - 560 nm, soit l’absorbance à 570 nm et 600 nm.