Mesure de la TEER dans des cellules épithéliales irradiées aux rayons X co-cultivées avec des PBMC

Résumé

Source : Babini, G., et al. Une méthode de co-culture pour étudier la diaphonie entre les cellules Caco-2 irradiées aux rayons X et le PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre la mesure de la résistance électrique trans-épithéliale dans les cellules Caco-2 irradiées, en présence et en absence de cellules PBMC. Cette méthode permet d’étudier les effets synergiques des radiations et des cellules immunitaires sur la barrière cellulaire épithéliale.

Protocole

1. Configuration de l’irradiation

Remarque : L’irradiation des cellules Caco-2 a été réalisée au service de radiothérapie de l’Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavie, Italie) avec un accélérateur linéaire couramment utilisé pour traiter différents types de cancers.

1. Réglez l’énergie des rayons X des photons sur 6 MV en crête. L’accélérateur linéaire fonctionne en régime pulsé (temps entre deux impulsions consécutives d’environ 4 ms ; durée d’une seule impulsion d’environ 5 μs avec un débit de dose allant jusqu’à 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Placez les plaques à 6 puits contenant des inserts avec Caco-2 sur la trajectoire des rayons X sur une plaque de plexiglas de 1,4 cm d’épaisseur (correspondant à une distance légèrement supérieure à l’accumulation du rayonnement utilisé) à 100 cm de la source de rayonnement.
3. Placez un bolus de 0,5 cm d'épaisseur sur chaque échantillon avant l'irradiation afin de garantir la composante de rayonnement rétrodiffusée et l'équilibre des particules chargées.
4. Irradier les cellules (doses comprises entre 2 et 10 Gy) avec un champ de rayonnement plat et symétrique (± 2 %) de 20 x 20 cm₂ et un débit de dose de 3 Gy/min.
   note: Les cellules témoins irradiées « fictives » ont subi les mêmes conditions procédurales que les cellules irradiées, sans entrer dans la salle d’irradiation (dose reçue : 0 Gy).
   prudence: Les appareils produisant des rayonnements ionisants ne doivent être utilisés que par du personnel spécialisé.

2. Résistance électrique trans-épithéliale (TEER)

1. Semez 5 × 10⁵ cellules Caco-2 une semaine avant l’irradiation dans des inserts de coculture sur plaque à 6 puits (polyéthylène téréphtalate (PET), 2 x 10⁶ pores/cm2).
2. 1 h avant l’irradiation, mesurez le TEER avec un voltmètre/ohmmètre.
3. Irradiez les cellules comme décrit aux étapes 1.1 à 1.4.
4. Incuber des cellules Caco-2 en présence/absence de co-culture avec PBMC à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
5. Pendant les premières heures suivant l’irradiation, mesurez TEER toutes les heures, puis toutes les 3 heures jusqu’à 48 heures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Inserts de culture cellulaire ThinCert 6 puits pour plaques multipuits	Greiner Bio-one	Référence 657610	équipement
Plaque multipuits de culture cellulaire, 6 puits	Greiner Bio-one	Référence 657160	plastique
Plaque multipuits de culture cellulaire, 24 puits	Greiner Bio-one	Référence 662160	plastique
RPMI 1640 sans L-Glutamine	Lonza	12-167F	Réactifs
Voltmètre/ohmmètre Millicell-ERS	Millipore	MERS 00001	équipement