Un dosage du biofilm sur plaque PEG pour le criblage d’agents antibactériens

Résumé

Source : Dalecki, A. G., et al. Ciblage du Staphylococcus aureus associé au biofilm à l’aide d’un test de sensibilité aux médicaments basé sur la résazurine. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente un test de dépistage de composés antimicrobiens qui éliminent efficacement les biofilms à l’aide d’une plaque cheville. La méthodologie surveille l'état métabolique du biofilm après un traitement avec des composés antimicrobiens, ce qui facilite la détermination de la concentration minimale d'éradication du biofilm.

Protocole

1. Initiation du biofilm

1. Cultivez une culture d’organismes producteurs de biofilm dans un milieu riche en nutriments. Inoculer la souche Newman de Staphylococcus aureus dans 10 ml de milieu Mueller-Hinton à partir d’un stock de glycérol. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité.
2. Incuber pendant 16 h à 37 °C sur un agitateur rotatif (100-200 tr/min).
3. Déterminer la DO₆₀₀ de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre et d’une cuvette étalon (longueur du trajet : 1cm).
4. Calculer le volume (V) de culture nécessaire pour préparer 20 ml d’inoculum avec une DO_{600 (inoculum)} de 0,1 dans un milieu chélexé du Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) à l’aide de la formule : [V = 20 ml*0,1/DO_{600 (culture)}].
   1. Ajoutez le volume de culture calculé (par le haut) dans un tube à centrifuger et des cellules de granulés en tournant pendant 1 min à 10 000 x g. Pour préparer l’inoculum de biofilm, aspirez le milieu de croissance épuisé et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans 20 ml de CRPMI.
5. Verser l’inoculum dans un réservoir de 25 ml.
6. Retirez délicatement le couvercle d’une plaque à chevilles stérile à 96 puits en le tirant vers le haut.
   Remarque : Veillez à ne pas contaminer les chevilles suspendues au couvercle. Le couvercle peut être placé à l’envers sur une surface propre à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.
7. À l’aide d’une pipette multicanaux de 200 μl, ajoutez 125 μl d’inoculum dans chaque puits des rangées A à G de la plaque inférieure.
8. Remplir 125 μl de milieu CRPMI stérile dans chaque puits de la rangée H pour contrôler la stérilité.
9. Prenez le couvercle de la cheville et tenez-le au-dessus du fond de la plaque avec les chevilles vers le bas. Alignez soigneusement les chevilles individuelles avec leurs puits respectifs. Évitez tout contact physique entre la plaque et les chevilles. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle. Évitez les désalignements, car les réajustements effectués après que les chevilles ont touché la plaque inférieure peuvent contaminer les commandes de stérilité dans la rangée H.
10. Fermez le couvercle sur la plaque avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et placez-le dans un sac en plastique refermable, en le fermant hermétiquement. Gardez le volume d’air dans le sac aussi bas que possible pour minimiser l’évaporation.
11. Incuber sans secouer à 37 °C pendant 48 h dans un incubateur à 5 % de CO₂.
    Remarque : 48 heures de croissance ont été optimales pour S. aureus, mais varieront en fonction de l’organisme utilisé.
    note: Bien que l’incubation statique soit un bon point de départ pour optimiser le dosage, l’agitation douce à 150 tr/min sur un agitateur de microplaques est une variation possible qui peut favoriser la formation de biofilm de certains isolats de S. aureus.

2. Préparation de la plaque de défi Biofilm

1. Le jour du défi du biofilm, prenez une nouvelle plaque de 96 puits et ajoutez 100 μl de CRPMI, équilibré à RT, dans chaque puits des rangées B à H. Pour éviter des résultats incohérents, utilisez une plaque à 96 puits qui peut contenir 200 μl de milieu lorsque les chevilles sont à l’intérieur, et comporte des puits dont les dimensions sont identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm.
2. Diluer séparément jusqu’à 4 composés d’essai dans 1,0 ml de CRPMI jusqu’à ce qu’ils soient 2 fois la concentration finale souhaitée, afin de tenir compte d’une dilution finale à l’étape 2.7.
   Remarque : Un bon point de départ est 8 fois supérieur à la concentration inhibitrice des cellules planctoniques.
3. Ajouter 200 μl du composé 1 dans les puits A1 à A3, le composé 2 dans les puits A4 à A6, le composé 3 dans les puits A7 à A9 et le composé 4 dans les puits A10 à A12.
4. Diluez en série les composés d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 μl de la rangée A à la rangée B et mélangez.
5. De cette manière, continuez à transférer 100 μl de puits à puits. Mélangez après chaque transfert et arrêtez-vous dans la rangée F.
6. Après le mélange, expulser 100 μl de la rangée F dans un conteneur à déchets. Ne transférez aucun liquide dans les rangées G et H.
7. Ajouter 100 μl de CRPMI dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanaux pour porter le volume à 200 μl. Voir la figure 1 pour la disposition finale de la plaque.

3. Défi du biofilm

1. Ajoutez 200 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une plaque fraîche et stérile de 96 puits comportant des puits de dimensions identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm.
2. Retirez le sac en plastique et le film de paraffine de la plaque d’amorçage du biofilm incubé.
3. Soulevez le couvercle vers le haut. Évitez tout contact entre les piquets et le fond de la plaque car cela pourrait endommager le biofilm. Conservez la partie inférieure pour l’analyse ultérieure de l’OD₆₀₀ (voir 3.8).
4. Rincez les cellules planctoniques en plaçant le couvercle de la cheville sur la plaque contenant le PBS (à partir de l’étape 3.1). Immergez les piquets pendant 5 secondes, soulevez-les hors du PBS et immergez-les une fois de plus, en faisant attention de ne pas heurter les piquets contre les côtés du puits.
5. Placez le couvercle de la cheville rincé dans la plaque de défi. Évitez tout contact inutile entre les chevilles et la plaque inférieure, car cela endommagerait le biofilm, ce qui entraînerait des résultats incohérents.
6. Scellez la plaque avec un film de paraffine et placez-la dans un sac en plastique refermable comme décrit à l’étape 1.10.
7. Incuber la plaque sans secouer pendant 24 heures à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
8. Prenez le bas de la plaque d’initiation du biofilm de la 3.3. Remettez les bactéries en suspension dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux et mesurez l’OD₆₀₀ avec un lecteur de microplaques approprié pour confirmer la croissance dans tous les puits, à l’exception des contrôles de stérilité dans la rangée H.

4. Détermination du biofilm

1. Utilisez un lecteur de plaques équipé d’une chambre d’incubation et capable de prendre des lectures de fluorescence cinétique pour détecter la conversion de la résazurine. Configurez une mesure cinétique de fluorescence sur 24 heures en utilisant une excitation de 530 nm et une émission de 590 nm.
2. Réglez la température de la chambre à 37 °C et faites lire la plaque toutes les 20 min. Réglez le lecteur de plaque pour qu'il mesure à partir du bas de la plaque conformément aux instructions du fabricant.
3. Préparez la plaque de lavage en ajoutant 200 μl de PBS à l’aide d’une pipette multicanaux sur une plaque stérile à 96 puits.
4. Préparez le milieu de récupération du biofilm en ajoutant 400 μl de solution mère de résazurine à 0,8 mg/ml à 20 ml de milieu CRPMI jusqu’à une concentration finale de 16 μg/ml de résazurine.
   note: La résazurine est un irritant cutané connu. Utilisez une blouse de laboratoire, des lunettes anti-éclaboussures et des gants lors de la manipulation. Le CRPMI comme milieu de récupération du biofilm a été utilisé parce qu’il fournit le signal de fond le plus faible, mais il peut être remplacé par un média Mueller Hinton si nécessaire.
5. Ajouter 150 μl de milieu de récupération du biofilm à l’aide d’une pipette multicanaux dans chaque puits d’une plaque fraîche à 96 puits.
6. Transférez la plaque de défi de l’incubateur dans une armoire de biosécurité et retirez soigneusement le sac en plastique et le film d’étanchéité.
7. Retirez le couvercle de la cheville de la plaque de défi et rincez les cellules planctoniques dans le PBS comme décrit en 3.4. Conservez le bas de la plaque de défi pour l’analyse ultérieure de l’OD₆₀₀ (voir 4.10).
8. Après le rinçage, placez le couvercle de la cheville dans le fond de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm.
9. Enveloppez le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention de ne pas obstruer le fond des puits périphériques. Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-la sur le lecteur de plaques et lancez une lecture cinétique sur une période de 24 heures en lançant le protocole cinétique resazurin précédemment conçu à partir de l’étape 4.1.
10. Pour quantifier la croissance des cellules planctoniques qui peut ou non se produire pendant le défi, lisez la DO₆₀₀ de l’ensemble du fond de la plaque de défi à l’aide d’un lecteur de microplaques. Suivez les instructions données à l’étape 3.8.
    Remarque : Remettez soigneusement en suspension le contenu de chaque puits car les cellules qui se détachent du biofilm ont tendance à se développer en amas au fond du puits. Toute bulle à l’intérieur du puits interférera fortement avec les lectures OD₆₀₀ et doit être évitée ou éliminée avant la lecture.

Résultats

Graphique 1. Disposition des plaques de défi. Exemple de disposition de la plaque de défi permettant des essais parallèles de quatre composés en trois exemplaires à six concentrations distinctes. Les contrôles non traités et de stérilité sont également inclus. La conception de la mise en page permet une préparation pratique dans la plaque de dilutions en série à l’aide d’une pipette multicanau...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Moyenne Mueller-Hinton	Oxoïde	CM0405	Suivez les recommandations du fabricant
RPMI-moyen	Corning	17-105-CV
Le CRPMI	Réf 9		RPMI-1640 moyennement chélexé pendant 1 heure avec de la résine Chelex 100, puis complété par 10 % de RPMI-1640 non chélexé
Résine Chelex 100	Bio Rad	Référence 142-2822
Plaques MBEC	Innovotech	19111
Sel de sodium de résazurine	sigma	Réf. R7017	800 μg/ml dans l’eau DI Filtre stérile
Plate-forme d’agitation de micro-plaques	Heidolph Titramax 1000
Lecteur de plaques Cytation 3	Biotek
Logiciel Gen5	Biotek		Enregistrement et analyse de la conversion resazurin
Néocuproine	sigma	N° N1501	Préparer un stock de 10 mM dans 100 % d’éthanol, stocker à -80 ºC
Sulfate de cuivre	Acros Organics	Référence 7758-99-8	Préparer une solution mère de 100 mM dans l’eau, conserver à 4 ºC
Cu-néocuproine	Fait maison		Généré en mélangeant des molarités égales de néoproïne et de sulfate de cuivre. Le mélange a été dilué dans un milieu CRPMI jusqu’à la concentration désirée.
gentamicine	sigma	Référence G3632-1G