Un test in vitro basé sur la fluorescence pour mesurer l’efficacité de l’étanchéité de la membrane plasmique

Dans cet article

Résumé

Source : Lam, J. G., et al. Mesure à haut débit de l’efficacité de refermeture de la membrane plasmique dans les cellules de mammifères. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente un test pour étudier l’efficacité de la refermeture de la membrane plasmique dans des cellules de mammifères. Les cellules sont exposées à une toxine bactérienne formant des pores, qui forme des pores dans la membrane cellulaire. En présence d’ions calcium extracellulaires, le pore provoque un afflux de calcium, induisant des événements de refermeture de la membrane. L’efficacité de refermeture est évaluée à l’aide d’un colorant à l’iodure de propidium se liant à l’ADN, qui ne pénètre que dans les cellules sans membrane refermée.

Protocole

1. Préparation

Placage de cellules
note: Des cellules épithéliales cervicales humaines, HeLa et HeLa exprimant l’histone 2B-GFP (H2B-GFP), ont été utilisées dans ce protocole, mais ce test peut être adapté à d’autres cellules de mammifères.
1. Détachez les cellules adhérentes d’une fiole de culture cellulaire de^{75 cm en} les lavant avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacer la trypsine utilisée par 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 % fraîche.
2. Incuber les cellules à 37 °C pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’elles se soient arrondies et détachées de la fiole.
3. Remettre les cellules en su....

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Résultats

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Figure 1 : Conception expérimentale. Le schéma de flux représente une conception de plaque représentative configurée pour tester l’effet de sept conditions d’essai par rapport aux cellules témoins non traitées. Des contrôles supplémentaires devraient être inclus si nécessaire, comme par exemple les véhicules de drogue. Les cellules sont plaquées (planche 1) 24 h avant l’expérience. Le jour de .......