1. Préparation
- Placage de cellules
note: Des cellules épithéliales cervicales humaines, HeLa et HeLa exprimant l’histone 2B-GFP (H2B-GFP), ont été utilisées dans ce protocole, mais ce test peut être adapté à d’autres cellules de mammifères.
- Détachez les cellules adhérentes d’une fiole de culture cellulaire de75 cm en les lavant avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacer la trypsine utilisée par 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 % fraîche.
- Incuber les cellules à 37 °C pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’elles se soient arrondies et détachées de la fiole.
- Remettre les cellules en suspension dans 8 mL de milieu de croissance (DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
- Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et de 10 μL de suspension cellulaire.
- Diluer les cellules dans un milieu de croissance à une concentration de 2,5 x 105 cellules/mL.
- Verser la suspension cellulaire dans un bassin de pipette stérile et bien mélanger la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml.
- À l’aide d’une micropipette multicanaux de 12 et d’embouts de 200 μL, répartissez les cellules HeLa (2,5 x 10 4 cellules/100 μL/puits) en trois exemplaires (ou quadruples) dans une plaque plate de 96 puits, à fond transparent, traitée pour culture tissulaire en polystyrène noir.
note: Un agencement de placage est présenté à titre d’exemple à la figure 1.
- Cultivez les cellules pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
- Préparation de la solution mère
- Préparez 1 L d’un stock de 10x de tampon M (utilisé pour préparer M1 et M2) en ajoutant 95 g de solution saline équilibrée Hanks, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) et 23,83 g de HEPES (100 mM) à 900 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,4 et augmentez le volume à 1 L. Filtrez pour stériliser.
- Préparez 50 ml d’un stock de glucose 50x (1,25 M) en ajoutant 11,26 g de D-(+)-glucose à un total de 50 ml d’eau. Filtrez pour stériliser la solution.
- Préparez 50 ml d’un stock de calcium 100x (120 mM) en ajoutant 0,666 g de CaCl2 à un total de 50 ml d’eau. Filtrez pour stériliser la solution.
- Préparez 50 ml d'une quantité 10x (50 mM) d'acide tétraacétique (EGTA) d'éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N',N'(EGTA) en ajoutant 0,951 g d'EGTA à 40 mL d'eau. Augmentez le pH à 8 en utilisant du NaOH pour dissoudre l’EGTA, puis augmentez le volume à 50 ml. Filtrez pour stériliser la solution.
- Pour une seule plaque à 96 puits, préparer 50 mL de Medium 1 (M1, contient du Ca2+), 50 mL de Medium 2 (sans M2, Ca2+) et 15 mL de Medium 2 complété par de l’EGTA, en conséquence :
- Pour M1, ajoutez 5 ml de 10x Buffer M, 0,5 mL de 100x CaCl2 et 1 mL de 50x glucose à 43,5 mL d’eau.
- Pour M2, ajoutez 5 ml de tampon 10x M et 1 mL de glucose 50x à 44 mL d’eau.
- Pour M2/EGTA, ajoutez 1,5 mL de 10x Buffer M et 1,5 mL de 10x EGTA à 12 mL d’eau.
note: Toutes les solutions contenant de l’iodure de propidium (IP) doivent être préparées directement avant d’être ajoutées aux cellules.
- Réglages du lecteur de plaques/cytomètre d’imagerie
note: Utilisez un lecteur de plaques multimode équipé de deux unités de détection : un spectrofluorimètre et un cytomètre imageur. Limitez l’exposition à la fluorescence pour éviter le photoblanchiment des fluorophores.
- Préchauffez le lecteur de plaques à 37 °C avant d’effectuer le dosage.
- Configurez les paramètres du dosage cinétique en conséquence dans le mode Paramètres :
- Choisissez Monochromateur, FL (fluorescence) et Cinétique pour la configuration optique, les modes de lecture et le type de lecture, respectivement.
- Sous Paramètres de longueur d’onde, sélectionnez respectivement une bande passante d’excitation et d’émission de 9 et 15 nm. Pour les dosages utilisant de l’iodure de propidium (PI), réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 535 et 617 nm, respectivement.
- Sous Type de plaque, sélectionnez 96 puits pour le format de plaque et une configuration de plaque prédéfinie correspondant à une plaque inférieure transparente à paroi noire.
- Sous Zone de lecture, mettez en surbrillance les puits qui seront analysés tout au long de la cinétique.
- Sous PMT et Optique, préréglez les clignotements par lecture sur 6 et cochez la case Lecture par le bas.
- Sous Timing, insérez 00:30:00 dans la zone Temps d’exécution total pour un test cinétique de 30 minutes, et insérez 00:05:00 pour l’intervalle.
Remarque : Pour chaque point temporel et une longueur d’onde, le temps de lecture d’une plaque complète de 96 puits est de 30 s.
- Confirmez les paramètres spécifiés dans les informations sur les paramètres à droite et sélectionnez OK. Appuyez sur Lire pour lancer l’exécution cinétique.
- Configurez les paramètres d’imagerie en conséquence dans le mode Paramètres :
- Choisissez Minimax, Imagerie et Point de terminaison pour la configuration optique, les modes de lecture et le type de lecture, respectivement.
- Sous Longueurs d’onde, sélectionnez la lumière transmise et l’une ou les deux cases de fluorescence correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 456/541 nm (GFP) et 625/713 nm (PI).
- Utilisez les mêmes options pour le type de plaque et la zone de lecture que celles définies aux étapes 1.3.2.3 et 1.3.2.4.
- Sous Paramètre de surface du puits, sélectionnez le nombre de sites à imager au sein d’un puits.
Remarque : 12 sites correspondent à une image de puits complet.
- Sous les paramètres d’acquisition d’image, sélectionnez les temps d’exposition pour la lumière transmise, 541 (GFP) et 713 (PI). Pour la GFP, imagez l’ensemble du puits avec un temps d’exposition de 20 ms/image. Pour la fluorescence en lumière transmise (TL) et PI, acquérez une seule image du centre de chaque puits avec des temps d’exposition de 8 et 20 ms, respectivement.
- Confirmez les paramètres spécifiés dans les informations sur les paramètres à droite et sélectionnez OK. Le temps d’acquisition pour l’imagerie de toute la surface de chaque puits (12 images/puits) d’une plaque de 96 puits et pour une longueur d’onde est de ~15 min. Appuyez sur Lire pour lancer imaging.
Remarque : Le temps d’acquisition d’une seule image/puits d’une plaque de 96 puits nécessite ~2,5 min/plaque pour une longueur d’onde. Les paramètres décrits ci-dessus correspondent à l’équipement spécifique de notre laboratoire. Mesures spectrofluorées : Une lampe flash au xénon affichant des longueurs d’onde d’excitation par incrément de 1,0 nm (250-850 nm) avec une bande passante réglable de 9 ou 15 nm, un détecteur à tube photomultiplicateur avec une plage dynamique logarithmique de > 6 et une bande passante d’émission réglable de 15 ou 25 nm. Cytomètre d’imagerie : Une source lumineuse d’éclairage capable d’émettre de la lumière blanche, des longueurs d’onde d’excitation de 460 nm et 625 nm avec une bande passante de 20 nm, des filtres d’émission centrés à 541 nm (bande passante de 108 nm) et 713 nm (bande passante de 123 nm), respectivement, et un objectif 4X couplé à une caméra de dispositif à couplage de charge de 1,25 mégapixel de 12 bits.
2. Dosage
Remarque : Au moment du dosage, les cellules doivent être confluentes à 70-90 %. Pendant les étapes de lavage, le milieu doit être retiré et appliqué sur la paroi latérale du puits (pas directement au-dessus des cellules). Maintenir la température du LLO à < 4 °C pour éviter son agrégation jusqu’à l’étape 3.1.5.
- Préparez un stock de 30 μM PI dans M1 et un stock de 30 μM PI dans M2 préchauffés à 37 °C.
- Lavez délicatement les cellules de la plaque 1 à l’aide d’une micropipette multicanaux de 12 pouces et d’embouts de 200 μL, comme suit :
- Dans des conditions propices à la réparation, retirer le milieu de croissance et laver les cellules deux fois avec 200 μL/puits M1 préchauffé à 37 °C. Remplacer le milieu par 100 μL/puits de M1 chaud contenant 30 μM PI.
- Pour les conditions restrictives de réparation, retirer le milieu de croissance et laver les cellules une fois avec 200 μL/puits chaud M2 contenant 5 mM d’EGTA pour chélater Ca2+, suivi d’un lavage avec 200 μL/puits M2. Remplacer le milieu par 100 μL/M2 bien chaud contenant 30 μM PI.
- Une fois que le milieu de culture a été lavé et remplacé par un milieu contenant de l’iodure de propidium, passez directement à l’étape 2.1.3.
- Plaque d’image 1 sous lumière transmise, GFP et PI comme détaillé au point 1.3.3 (pré-cinétique). Cette étape dure 15 à 20 min.
- Pendant la période de 15 minutes décrite à l’étape 2.1.3, préparer la plaque 2 à l’aide d’une micropipette multicanaux de 12 et d’embouts de 200 μL comme suit :
- Placez une microplaque en polypropylène à fond rond de 96 puits sur de la glace. Configurez la plaque à l’aide d’un plan d’expérience correspondant à la plaque 1 (Figure 1).
- Dans les conditions où la réparation est permissive, ajouter 100 μL/puits de glace M1 contenant 60 μM PI, suivi de l’ajout de 100 μL/puits de glace M1 contenant 4x LLO ou non pour le contrôle.
- Dans des conditions de réparation restrictives, ajouter 100 μL/puits de M2 glacé contenant 60 μM d’IP, suivi de l’ajout de 100 μL/puits de M2 glacé contenant 4x LLO ou non pour le contrôle.
- Après avoir numérisé la plaque 1 (étape 2.1.3), placez-la immédiatement sur de la glace, à l’aide d’une feuille d’aluminium pour séparer la plaque du contact direct avec la glace. Laisser refroidir la plaque 1 pendant 5 min.
- À l’aide d’une micropipette multicanaux de 12 et d’embouts de 200 μL, transférez 100 μL de chaque puits dans la plaque 2 (étape 2.1.4) dans les puits correspondants de la plaque 1. Pour bien répartir la toxine dans le milieu de la plaque 1, insérez les pointes sous le ménisque et éjectez doucement le volume sans introduire de bulles.
Remarque : Ne pipetez pas de haut en bas, car cela pourrait détacher les cellules par inadvertance.
- Laissez la plaque pendant 1 minute supplémentaire pour permettre à la toxine de se lier aux cellules et transférez immédiatement la plaque 1 vers le lecteur de plaque pour le test cinétique à l’aide du mode spectrofluorimètre (étape 1.3.2).
- À la fin de l’essai cinétique, imager immédiatement la plaque 1 (post-cinétique) à l’aide de l’étape 1.3.3.
3. Analyse : énumération de cellules
- Déterminez le nombre de cellules en fonction de la fluorescence nucléaire à l’aide du logiciel de dénombrement des cellules sur microplaques.
- Dans les paramètres, sélectionnez Réanalyse, et sous la section de catégorie des paramètres d’analyse d’image, sélectionnez Analyse d’objet discrète en utilisant 541 comme longueur d’onde pour la recherche d’objets.
- Dans l’option Rechercher des objets, à l’aide de la méthode de recherche Dessiner sur des images, sélectionnez Noyaux sous l’onglet Paramètres, puis appuyez sur Appliquer.
- Appuyez sur OK et sur Lire pour lancer l’algorithme de comptage des cellules.
