Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Fixation des tissus par le formol
- Placer des tissus cérébraux de 3 à 5 mm prélevés après l’autopsie dans une solution de formol tamponnée à 10 % de phosphate (rapport tissu/formol de 1:20 à 1:50) pendant 24 à 72 h
prudence: Le formol est un fixateur toxique.
- Notez le poids approximatif des tissus (taille), le type de tissu (zones cérébrales) et le volume de formol. Il est important que les laboratoires documentent et tiennent des registres sur les temps de fixation.
- Pour un stockage plus long des tissus après la fixation du formol et avant le traitement, placez les tissus dans de l’éthanol à 70 %.
2. Traitement des tissus
- Après la fixation de l’échantillon, disséquez le tissu pour inclure les zones cérébrales importantes, par exemple des coupes transversales du tronc cérébral, du cervelet (3 lobes) ou de l’hippocampe (les deux hippocampes) chacune coupée de 3 à 5 mm d’épaisseur et placée dans des cassettes de traitement.
- Traitez les cassettes de tissus pour l’infiltration de cire de paraffine, noyées dans des blocs de paraffine et sectionnées (3 à 6 μm) sur un microtome.
3. Préparation des matériaux / Coloration des plats
- Installez le plat de coloration (table des matériaux) comme illustré à la figure 1. Remplissez chaque plat avec 250 ml de la solution.
- Préparation de la solution mère de substrat de 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC)
- Dissoudre un comprimé de 20 mg de 3-amino 9-éthylcarbazole (AEC) dans 5 mL de N,N, diméthylformamide à l’aide d’une pipette en verre.
prudence: L’AEC est cancérigène.
- Préparation de la solution mère de protéase (p. ex., Pronase) pour le prélèvement de l’antigène
- Dissoudre 7 mg de protéase dans 200 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparation du tampon de rinçage PBS-T
- Ajouter 10 mL de Tween 80 à 990 mL de PBS. Mélangez bien pour former une solution homogène.
4. Déparaffinisation et réhydratation tissulaire
- Faites une section de paraffine de 5 μm à l’aide d’un microtome, faites-la flotter sur un bain-marie à 38 °C et recueillez-la sur des lames de verre. Étiquetez les lames à l’aide d’un stylo/marqueur résistant aux réactifs.
- Placez les lames sur une plaque et faites-les fondre dans un four à 55-60 °C pendant 1 heure. N’augmentez pas la température au-dessus de 60 °C car cela peut détruire l’antigène viral.
- Sortez les lames du four et déparaffinisez immédiatement en 3 rinçages consécutifs au xylène de 5 minutes chacun dans les plats 1, 2 et 3.
- Réhydrater les sections de la lame par immersions séquentielles dans la dilution décroissante de l’éthanol dans de l’eau désionisée : (4 à 11 est un rinçage par trempage) plat 4 : xylène/100 % éthanol (1:1) ; plat 5 : 100 % d’éthanol ; plat 6 : 100 % d’éthanol ; plat 7 : 95 % d’éthanol ; plat 8 : 95 % d’éthanol ; plat 9 : 80 % d’éthanol ; plat 10 : 70 % d’éthanol ; plat 11 : eau déminéralisée (Figure 1. Configuration de l’antenne).
prudence: Le xylène est un produit chimique dangereux et le travail doit être effectué dans une hotte.
5. Récupération de l’antigène protéolytique
- Traiter les lames avec la protéase (2,5 μg/mL de PBS) pendant 30 minutes pour le prélèvement de l’antigène protéolytique dans la boîte 12.
- Rincer ensuite au PBS-T pendant 10 min (plat 13).
- Traiter avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min (parabole 14).
- Encore une fois, laver avec du PBS-T pendant 10 min (plat 15).
6. Procédure de coloration
- Manipulez les diapositives une par une en gardant les lames restantes immergées dans la mémoire tampon (ne retirez pas tout le support de diapositives - gardez les lames humides). Retirez une lame et épongez l’excès de tampon (à l’aide d’une serviette en papier) autour de la section du tissu, en prenant soin de ne pas déranger la section du tissu. Incuber les lames dans une chambre d’humidité, en plaçant des serviettes en papier humidifiées, sur la paillasse de laboratoire à température ambiante avec du sérum de chèvre normal (blocage) pendant 15 min.
- Incuber avec la dilution prédéterminée optimale de l’anticorps antirabique primaire (dilution 1:250 du sérum antirabique de souris, non publiée) (contrôle positif) et des anticorps témoins négatifs à la température ambiante comme ci-dessus (étape 6.1.) pendant 60 minutes sans lavage entre les deux.
- Après 60 min, laver avec du PBS-T pendant 10 min (plat 16).
- Incuber avec l’anticorps biotinylé (spécifique à l’espèce) dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 15 min (manipulation identique à l’étape 6.1.).
- Laver avec du PBS-T pendant 10 min (plat 16).
- Incuber avec le complexe streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 15 min (manipulation identique à 6.1.).
- Laver avec du PBS-T pendant 10 min (plat 16).
- Incuber avec un substrat de peroxydase, l’amino-éthylcarbazole (AEC), dans une chambre humide à température ambiante pendant 10 min. Effectuer l’AEC juste avant l’utilisation. Pour ce faire, ajoutez 1 mL de solution mère AEC à 14 mL de tampon d’acétate 0,1M, pH 5,2. Ajouter 0,15 mL de peroxyde à 3 %, H2O2. Filtrer le mélange juste avant utilisation (filtre 0,45 μm).
note: La solution de travail de l’AEC n’est stable que pendant 2-3 heures. La solution mère AEC peut être conservée au réfrigérateur pendant de plus longues périodes.
- Laver à l’eau déminéralisée pendant 10 min (plat 17)
- Contre-coloré avec de l'hématoxyline de Gill dilué 1:2 avec de l'eau désionisée pendant 2 min (plat 18).
- Rincez l’excès d’hématoxyline avec un rinçage à l’eau déminéralisée (plats 19 et 20).
- Rincer à l'eau du robinet Scott's pendant 30 secondes (solution bleuissante) plat 21.
- Laver à l’eau déminéralisée pendant 10 min (plat 22)
- Retirez les diapositives une par une - montez-les avec un support de montage soluble dans l’eau.
- Lire des lames au microscope optique.
