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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation histopathologique et traitement après l’obtention d’une biopsie de l’artère temporale
REMARQUE : La biopsie de l’artère temporale (TAB) est réalisée sous anesthésie locale et dans des conditions stériles par un chirurgien certifié. Après avoir obtenu chirurgicalement une section artérielle de 3 cm du côté le plus affecté, l’échantillon est fixé dans du formol immédiatement pendant 24 heures, divisé en sections de 3 à 4 mm, et noyé dans de la paraffine, en accordant une attention particulière à l’alignement correct des tissus dans le bloc qui est ensuite stocké à température ambiante. La sélection des échantillons est effectuée après vérification des dossiers médicaux. Le diagnostic est basé sur les critères de l’American College of Rheumatology de 1990 qui exigent que les sujets remplissent 3 des 5 domaines : l’âge >50 ans, un nouveau mal de tête, une sensibilité de l’artère temporale, une vitesse de sédimentation érythrocytaire >50 mm/heure par la méthode Westergren, et une TAB anormale. Pour des raisons de sécurité, des gants de protection doivent être portés en permanence lors de la manipulation d’échantillons, produits chimiques et anticorps.
- À partir des blocs encastrés, coupez des sections de 4 à 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et colorez avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E). Utilisez une section témoin de tissu normal sélectionné pour l’assurance de la qualité.
- Placez les sections coupées au flotteur sur un bain d’eau chaude chauffé à 40 °C pour éliminer les plis et ramassez-les avec une lame microscopique en verre revêtu. Placez les lames de verre sur une plaque chaude dans un four à 60 °C pendant 60 minutes pour faciliter le séchage et l’adhérence de la section à la lame.
- Placez les lames de verre sur une plaque chaude dans un four à 60 °C pendant 60 minutes pour faciliter le séchage et l’adhérence de la section à la lame.
- Montage de 3 sections sur des lames de microscope.
- Placez les lames sur une grille verticale et faites-les sécher pendant une nuit à 37 °C pendant 24 h.
- Placez les lames dans un récipient et conservez-les à 4 °C.
2. Préparation immunohistochimique, déparaffinage, récupération d’antigènes et coloration
- Chargez les glissières dans un support à glissières. Passez la grille dans la vaisselle comme suit : deux fois dans du xylène à 100 % pendant 5 minutes avec 10 secondes d’agitation douce toutes les 30 secondes, une fois dans de l’éthanol à 100 % avec une agitation de 10 secondes, une fois dans de l’éthanol à 90 % avec une agitation de 10 secondes, une fois dans de l’éthanol à 70 % avec une agitation de 10 secondes et deux fois dans du H2O distillé deux fois avec une agitation de 10 secondes.
note: La manipulation du xylène et de l’acétone doit se faire dans des cagoules ventilées pour éviter l’inhalation et la toxicité respiratoire.
- Récupérez l’antigène en transférant le support dans un récipient en verre contenant 200 ml de 10 mmol/L, un tampon de citrate de pH 6,0 préchauffé à 95 °C. Réglez la minuterie sur 30 minutes dans le bain-marie, puis laissez refroidir à température ambiante pendant 20 minutes, puis rincez à l’eau courante pendant 5 minutes.
- Éliminer l’activité de la peroxydase endogène en l’incubant dans 200 mL de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes. Laver les lames 3 fois dans 200 μL de solution saline tamponnée au Tris (TBSS).
- Retirez les lames de la grille et tamponnez doucement chacune d’elles pour essuyer l’excès de tampon. Pour la coloration, ajoutez 200 μL des anticorps primaires suivants, ajoutez des lamelles sur les lames et incubez dans une chambre humide pendant 1 heure à température ambiante :
Anticorps anti-récepteur bêta (FRB) dilué 1:800
Souris monoclonale anti-humaine CD68, dilution 1:200
Polyclonal de lapin anti-CD3 dilution 1:100
note: Des coupes du placenta fixées au formol et incluses dans de la paraffine ont également été traitées comme indiqué aux étapes 2.1 à 2.9, puis incubées avec de l’anti-FRB18 et utilisées comme témoin positif. Les résultats de la coloration ont été obtenus en trouvant la concentration optimale d’anticorps et ont été effectués en titrant l’anticorps en doubles dilutions (par exemple, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Retirez la lamelle après l’incubation et jetez-la. Rincez les lames 3 fois pendant 2 minutes chacune avec du TBSS, égouttez-les et essuyez l’excès de tampon.
- Ajouter 200 μL de solution d’anticorps secondaires contenant de l’anticorps secondaire biotinylé anti-lapin/souris pour réagir avec l’anticorps primaire non conjugué lié à l’antigène tissulaire. Placez les lamelles sur les lames et incubez dans une chambre humide pendant 45 minutes à température ambiante.
- Retirez la lamelle après l’incubation et jetez-la. Rincez les lames 3 fois pendant 2 minutes chacune avec du TBS, égouttez-les et essuyez l’excès de tampon.
- Ajoutez 200 μL de diaminobenzidine (DAB) + tampon de substrat (imidazole HCl) -système chromogène et incubez pendant 10 minutes pour visualiser le motif de coloration. Laver avec du TBSS puis à l’eau courante du robinet pendant 10 minutes.
- Contre-colorez avec de l’hématoxyline pendant 3 minutes.
- Montez les lames en appliquant 70 μL de support de montage sur la surface de la diapositive. Basculez lentement la lamelle sur le support de montage et évitez de créer des bulles lorsque vous l’abaissez en place. Attendre 24 heures pour sécher.
3. Analyse histopathologique et immunohistochimique (IHC)
Examinez les coupes colorées H&E et IHC de sujets GCA positifs et normaux à l’aide d’un microscope optique.
- Pour les sections teintées H&E
- Évaluer l’architecture vasculaire et identifier les cellules endothéliales de la tunique intima, les cellules musculaires lisses de la tunique médiane et les fibroblastes et le vasorum de la tunique adventice.
- Identifier les caractéristiques de l’ACG, notamment l’infiltration de lymphocytes et de macrophages/histiocytes, l’hyperplasie cellulaire et la dégradation de la lame élastique interne.
- Analyser l’infiltrat lymphohistiocytaire en identifiant et en quantifiant le nombre de macrophages par rapport aux lymphocytes. Évaluez l’étendue de la rupture de la lame élastique interne et des changements hyperplasiques dans les cellules résidentes et comparez-les avec des témoins.
- Pour les sections colorées IHC
- Examinez le modèle de coloration du FRB, en prenant note de son expression par un ou plusieurs types particuliers de cellules et de sa distribution dans les couches vasculaires et de sa relation avec l’infiltrat immunitaire total, le marqueur macrophage total, anti-CD68, et le marqueur panlymphocytaire anti CD3.
- Quantifiez l’expression des cellules FRB, CD68 et CD3 en comptant les cellules colorées positivement sur 10 champs de haute puissance (hpf) multiples sélectionnés au hasard et enregistrez les moyennes.
note: L’identification de ces cellules et structures normales et pathologiques a été effectuée par un pathologiste cardiovasculaire et un rhumatologue certifiés, et les résultats ont été enregistrés pour tous les cas.
- Capturez des images représentatives à l’aide d’un appareil photo numérique.
REMARQUE : Après ces étapes, les aliquotes restantes peuvent être stockées à -80 °C.