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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Prélèvement de tissus et réticulation UV
- Euthanasiez 2 souris adultes avec du dioxyde de carbone (CO2) pendant 1 à 2 minutes ou jusqu’à ce que la respiration cesse. Ensuite, effectuez une luxation cervicale sur chaque souris.
- Prélevez environ 100 mg de testicules de souris d’âge approprié (un testicule adulte dans cette étude) pour chaque expérience d’immunoprécipitation, et placez les tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée.
- Retirez délicatement la tunique albuginée à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine.
- Ajouter 3 ml de PBS glacé dans un broyeur de mouchoirs et triturer le mouchoir par une légère force mécanique à l’aide d’un pilon en verre lâche (pilon en verre de type A).
REMARQUE : Le but de cette étape n’est pas de lyser les cellules, mais de séparer le tissu. La préservation de la viabilité et de l’intégrité des cellules est importante.
- Transférez la suspension tissulaire dans une boîte de culture cellulaire (10 cm de diamètre) et ajoutez du PBS glacé jusqu’à 6 ml.
- Secouez rapidement l’assiette pour que le liquide recouvre uniformément le fond du plat. Si le tissu est correctement broyé, des tubes séminifères uniformément répartis seront visibles, tandis que la présence d’amas de tissus indique que la dispersion tissulaire n’est pas optimale.
- Réticulation de la suspension à trois reprises avec 400 mJ/cm2 à 254 nm sur la glace. Mélanger la suspension entre chaque irradiation.
note: Pour chaque nouvelle expérience, la réticulation doit être optimisée.
- Prélever la suspension dans un tube conique de 15 mL et la granuler à 1 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS, puis transférer la suspension dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Essorer à 4 °C et 1 000 x g pendant 2 min, puis retirer le surnageant.
- À ce stade, passez immédiatement au reste du protocole, ou congelez les granulés dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparation des perles
- Ajouter 125 μL de billes magnétiques de protéine A par échantillon (pastille) dans un tube à centrifuger frais.
note: Utilisez des billes magnétiques de protéine G pour les anticorps de souris.
- Placez le tube sur l’aimant pour séparer les billes de la solution. Après 10 s, retirez le surnageant. Lavez les billes deux fois avec 1 ml de tampon de lyse glacé.
note: La séparation ultérieure des billes magnétiques de la protéine A suit cette étape. La composition du tampon de lyse est de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 100 mM NaCl ; 1 % NP-40 ; 0,1 % SDS ; 0,5 % de désoxycholate de sodium ; Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 1/50 (ajouter frais).
- Remettre en suspension les billes dans 100 μL de tampon de lyse à froid avec 10 μg d’anticorps eCLIP. Faites pivoter les tubes à température ambiante pendant 45 min
note: La concentration finale d’anticorps pour l’immunoprécipitation est de 10 μg/mL. Si la concentration d’anticorps est inconnue, la quantité d’anticorps doit être optimisée.
- Lavez les billes deux fois avec 1 mL de tampon de lyse glacé.
3. Lyse tissulaire et digestion partielle de l’ARN
- Remettre les pastilles tissulaires en suspension dans 1 mL de tampon de lyse à froid (ajouter 22 μL de cocktail d’inhibiteurs de protéines 50x (EDTA) et 11 μL d’inhibiteur de RNase à 1 mL de tampon de lyse).
- Remettre en suspension deux pastilles réticulées par UV et deux pastilles non réticulées par groupe d’expériences : pastilles réticulées UV-1 pour la bibliothèque eCLIP (UV-1) ; pastilles réticulées UV-2 pour la bibliothèque eCLIP (UV-2) ; pastilles non réticulées-1 pour la bibliothèque eCLIP en tant que contrôle (non UV) ; pastilles non réticulées-2 pour l’IP IgG afin de démontrer la spécificité des anticorps.
note: Le contrôle idéal pour la bibliothèque eCLIP des testicules de type large réticulés par UV est celui des testicules knock-out réticulés par UV de souris de la même portée.
- Continuez à lyser les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes (pour éviter la dégradation des protéines et de l’ARN).
- Sonicate dans un sonicateur numérique à 10 % d’amplitude pendant 5 min, à 30 s de marche/30 s de désactivation. Placez toujours l’échantillon sur de la glace et nettoyez la sonde avec de l’eau sans nucléase entre chaque échantillon.
- Ajouter 4 μL de DNase dans chaque tube et bien mélanger. Incuber pendant 10 min à 37 °C, en secouant à 1 200 tr/min.
- Ajouter 10 μL de RNase I diluée (4 U/μL de RNase I dans du PBS) et bien mélanger. Incuber pendant 5 min à 37 °C, en secouant à 1 200 tr/min.
- Éliminer le lysat par centrifugation à 15 000 x g pendant 20 min (à 4 °C).
- Récupérez soigneusement le surnageant. Laissez 50 μL de lysat et jetez la pastille avec.
- Enregistrez les échantillons d’entrée au format RWB (run for western blot) et RRI (run for RNA isolation). Conservez 20 μL (2 %) d’échantillons UV-1, UV-2, non UV et IgG comme intrants pour la charge de gel RWB. Conservez 20 μL (2 %) d’échantillons UV-1 ou UV-2 comme intrants pour le chargement en gel RRI.
4. Immunoprécipitation
- Ajouter 1 mL de lysat (de l’étape 3.7) aux billes (préparées à la section 2) et faire pivoter les échantillons à 4 °C pendant 2 h ou toute la nuit.
- Récupérez les perles à l’aide d’un support magnétique et jetez le surnageant. Lavez les billes deux fois avec 900 μL de tampon à haute teneur en sel (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 1 M NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 % NP-40 ; 0,1 % SDS ; 0,5 % de désoxycholate de sodium), puis lavez les billes deux fois avec 900 μL de tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 10 mM MgCl2 ; 0,2 % Tween-20).
note: Pour l’échantillon IgG, interrompez la procédure ici et conservez-le sur de la glace dans un tampon de lavage.