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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des matériaux pour l’injection
- Stériliser une aiguille et une seringue de 33 G : démonter et autoclaver à 115 οC. Préparer les aiguilles pour l’injection en les levant dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
- Décongeler les particules marquées par fluorescence à température ambiante pendant 5 à 10 min. Préparer la solution de particules pour injection en la reconstituant en une solution à 50 mg/ml dans du PBS stérile avec des ions calcium et magnésium (Ca2+/Mg2+).
note: Des particules d’origine fongique marquées AF488 qui ont été validées pour des tests de phagocytose sont utilisées dans ce protocole. Pour une absorption optimale, préparez les particules fraîches et immédiatement avant l’injection.
REMARQUE 2 : Les concentrations de particules peuvent être optimisées pour chaque expérience spécifique.
2. Injection intravitréenne de solution de billes
REMARQUE : Deux personnes sont nécessaires pour effectuer l’injection, de manière à ce que la personne qui effectue l’injection puisse tenir la souris et maintenir la concentration sur le globe oculaire, tandis que l’autre personne passe la seringue chargée et pousse le piston.
- Anesthésier le rongeur par injection intrapéritonéale de 100 mg/ml de kétamine et de 10 mg/ml de xylazine à une dose de 20 μl/10 g de poids corporel. Avant l’injection, utilisez une pince des orteils pour évaluer le niveau d’anesthésie.
note: L’isoflurane a un effet profond sur la fonction des cellules myéloïdes, par conséquent, son utilisation tout au long de ce test doit être évitée.
- Chargez l’aiguille avec 0,5 μl de solution de particules marquées par fluorescence.
- Posez la souris sur le côté sous un microscope chirurgical (Figure 1A-B). Utilisez un matériau doux, par exemple un pack de gel, pour un meilleur positionnement de la souris. Pour les jeunes souris chez lesquelles les yeux ne sont pas encore ouverts, ouvrez doucement les paupières à l’aide d’une pince fine à 45o en créant une fissure le long de la fente à partir de laquelle les paupières finiront par s’ouvrir.
- À l’aide d’une pince fine coudée de 45o, appliquez soigneusement une pression autour de la paupière, de sorte que le globe oculaire sorte légèrement de l’orbite. Tenez la tête avec deux doigts juste au-dessus de l’oreille et par sa mâchoire et étirez doucement la peau parallèlement aux paupières pour garder l’œil légèrement hors de l’orbite. Veillez à ne pas saisir trop près de la gorge (Figure 1B).
- Pour percer le globe oculaire, insérez l'aiguille de la seringue dans le limbe cornéen (là où la cornée et la sclérotique se connectent). Ceci est visible sous la forme d’un cercle gris chez les souris pigmentées. Rétractez légèrement l’aiguille pour expulser un petit volume de liquide vitré, puis injectez. La personne qui effectue l’injection doit tenir doucement la souris d’une main et l’aiguille de l’autre ; La deuxième personne doit pousser lentement le piston.
- Rétractez lentement la seringue. Appliquez des gouttes hydratantes pour les yeux pour garder l’œil hydraté.
- Laissez le rongeur se rétablir dans une cage sur un coussin chauffant et continuez à surveiller l’animal. Si vous travaillez avec des petits, ne retournez pas l’animal dans une cage avec d’autres animaux alertes jusqu’à ce qu’il respire et soit capable de se déplacer spontanément. Si vous travaillez avec des adultes, ne retournez pas le rongeur dans une cage avec d’autres animaux alertes jusqu’à ce qu’il retrouve sa position couchée sternale.
3. Prélèvement de tissu rétinien
REMARQUE : Le tissu rétinien des yeux non injectés avec des particules marquées par fluorescence doit être prélevé comme contrôle pour l’analyse cytométrique en flux. Bien que le test puisse être effectué à l’aide d’une seule rétine, pour de meilleures performances, deux rétines doivent être regroupées.
- Prélever le tissu rétinien 3 heures après l’injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence.
note: Bien que le temps après l’injection de la solution de particules puisse être optimisé pour chaque expérience spécifique, nous avons constaté que 3 heures après l’injection, l’absorption des particules pouvait être observée dans la plupart des couches de la rétine (Figure 1C-D).
- Souris sacrifiées par luxation cervicale.
- Prélevez les globes oculaires en appuyant doucement contre la paupière à l’aide d’une pince fine coudée de 45o pour proptoser le globe oculaire. Placez la pince derrière le globe oculaire et tirez.
- Disséquez la rétine à l’aide d’un microscope à dissection. Transférez le globe oculaire dans une boîte de Pétri contenant une petite quantité de PBS avec Ca2+/Mg2+. Dans une zone sèche de la boîte de Pétri, percez le globe oculaire dans le limbe cornéen avec la pointe d’une pince ultrafine.
- Tenez le globe oculaire à l’aide d’une pince fine coudée de 45o et utilisez des ciseaux à ressort pour couper autour du limbe cornéen, jusqu’à ce qu’environ la moitié de la circonférence du membre cornéen soit coupée.
- Tenez le globe oculaire à l’aide de la pince fine coudée de 45o et amenez le globe oculaire dans le PBS. Avec une deuxième paire de pinces fines coudées de 45o, déchirez la cornée et la sclérotique. Le cristallin et la rétine en ressortiront intacts.
- Séparez le cristallin et la rétine. Prélevez la rétine et transférez-la dans un tube à essai en polystyrène de 5,4 ml contenant 2 ml de PBS avec Ca2+/Mg2+.
4. Préparation d’une suspension à cellule unique
- Préparez des suspensions unicellulaires à l'aide d'un kit de dissociation des tissus neuronaux avec des modifications mineures aux instructions du fabricant. Brièvement, triturez les rétines en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 et en effectuant une digestion enzymatique à 37 °C sans agiter.
5. Coloration des suspensions unicellulaires pour l’analyse cytométrique en flux
- Remettre les cellules en suspension dans 200 μl de tampon de coloration (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec 0,2 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 0,09 % d'azoture de sodium) et les transférer dans une plaque à fond en U à 96 puits. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g.
note: L’azoture de sodium est nocif pour l’homme et l’environnement. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et jetez les déchets conformément aux réglementations locales.
- Retournez la plaque au-dessus d’un évier pour jeter le surnageant. Pour bloquer les récepteurs Fc, remettre les cellules en suspension dans 25 μl de tampon de coloration contenant 5 μg/ml d’anticorps anti-souris CD16/CD32 par puits. Incuber 5 min à température ambiante.
- Ajouter 25 μl de tampon colorant contenant 0,5 μg/ml de Ly6C-APC-Cy7 anti-souris, 0,5 μg/ml de Ly6G-Pe-Cy7 et 2,5 μg/ml de CD11b-BV650 anti-souris. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Centrifuger pendant 5 min à 130 x g. Retourner la plaque pour jeter le surnageant. Laver en remettant les cellules en suspension dans 200 μl de tampon de coloration.
- Centrifuger pendant 5 min à 130 x g. Remettre en suspension dans 200 μl de tampon de coloration contenant 0,5 μg/ml d’iodure de propidium (PI). Transférer dans des tubes de microtitration de 1,2 ml.
- Laver les puits avec 100 μl supplémentaires de tampon de coloration contenant 0,5 μg/ml d’IP et stocker les 200 μl précédents dans les tubes de microtitration de 1,2 ml. On obtient un volume total de 300 μl de cellules colorées.
6. Analyse par cytométrie en flux
- À l’aide de trois lasers conventionnels (laser violet, bleu et rouge), évitez les colorants PE, PerCP-Cy5.5, BV510 et PI en raison d’un débordement important des particules fluorescentes AF488 extrêmement brillantes. Utilisez un quatrième laser (jaune) pour optimiser ce test, car il permet d’utiliser des anticorps marqués en PE et des PI (dans le canal mCherry au lieu du canal PerCP-Cy5.5) (Figure 2).
note: Si aucun laser jaune n’est disponible, utilisez un colorant d’exclusion des cellules mortes dans un autre canal.
- Gate sur les cellules PI négatives (PI-) pour exclure les cellules mortes (Figure 2B).
- Après avoir exclu les cellules mortes, on se concentre sur les cellules CD11b positives (CD11b+), ce qui inclura toutes les cellules myéloïdes (Figure 2C).
- Au sein de la population CD11b+, repérer Ly6C-/Ly6G- pour exclure les neutrophiles (CD11b+/Ly6G+) et les monocytes (CD11b+/Ly6C+ ; Figure 2D). Après le contrôle sur la microglie (définie ici comme CD11b+/Ly6C-/Ly6G- pour simplifier), deux populations claires doivent être visibles ; un négatif et un positif pour les particules marquées par fluorescence. Les cellules phagocytaires auront absorbé des particules et sont donc AF488+ (Figure 2E).
note: Les populations positives Ly6C ou Ly6G positives peuvent également être analysées pour mesurer l’absorption de particules à l’aide de cette approche de coloration. Le pourcentage de cellules phagocytaires CD11b+ est bien corrélé avec le pourcentage de microglie phagocytaire (Figure 2F). Pour les chercheurs sans expérience de la cytométrie en flux, une analyse plus simple avec la coloration CD11b seule peut être effectuée, bien qu’elle inclue les neutrophiles et les monocytes phagocytaires, ainsi que les microglies. Au sein de cette population CD11b+/Ly6C-/Ly6G-, ces cellules sont > 99 % de microglie comme en témoigne la coloration avec les marqueurs F4/80 et CX3CR1 ; Ces marqueurs peuvent être ajoutés mais ne sont pas nécessaires entre nos mains.
