Un test de cytométrie en flux pour identifier des sous-ensembles de cellules immunitaires dans des cellules mononucléées du sang périphérique

Résumé

Source : Torchia, M. L. G., et al. Discrimination de sept sous-ensembles de cellules immunitaires par cytométrie en flux à deux fluorochromes. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente une technique basée sur la cytométrie en flux utilisant deux fluorochromes pour identifier les lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺, les lymphocytes T γδ, les lymphocytes B, les cellules tueuses naturelles (NK) et les monocytes dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). Lors de l’incubation des cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre les marqueurs de surface, les sous-ensembles cellulaires sont identifiés à l’aide d’une stratégie optimale de cytométrie en flux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

NOTE : Ce protocole a été testé sur des cellules sanguines périphériques isolées fraîches ou congelées et du sang total.

1. Coloration cellulaire

REMARQUE : Il est important de choisir des paires de fluorochromes avec pratiquement aucun chevauchement spectral pour réduire la dispersion des données en raison du fort débordement d’un fluorochrome dans l’autre détecteur de fluorochromes. Pour obtenir une identification optimale de tous les sous-ensembles cellulaires, il faut utiliser des fluorochromes à haut rendement quantique, tels que les paires d’anticorps PE-BV421 et PE-APC.

1. Coloration des PBMC frais et congelés
   1. Transférez 100 μL de PBMC (1 x 10⁶ cellules) sur une plaque à fond en V de 96 puits.
      note: N’importe quel nombre de cellules inférieur à 1 x 10⁶ peut être utilisé avec des résultats similaires.
   2. Centrifuger à 350 x g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ajouter à chaque puits 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant un colorant fixable vivant/mort qui réagit avec l’amine libre sur les protéines pendant 10 min pour marquer les cellules mortes.
   3. Préparez pour chaque échantillon 30 μL d’un mélange contenant tous les anticorps (anti-CD3. -CD56, TCRγδ dans le fluorochrome A, et anti-CD4, CD8, CD19, CD14 dans le fluorochrome B). Les concentrations d’anticorps sont indiquées dans les tableaux 1 et 2. À ce stade, des anticorps titrés contre différentes molécules cibles et dans différents fluorochromes peuvent également être ajoutés (par exemple, tableau 3).
      note: La concentration en anticorps peut varier en fonction du fabricant et du numéro de lot. Par conséquent, des tests préliminaires doivent être effectués pour obtenir le signal optimal. Le PBS, le PBS/0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), le PBS/0,2 % d’azoture de sodium ou le PBS/0,5 % de BSA/0,1 % d’azoture de sodium ont été utilisés avec des résultats similaires pour diluer les anticorps. Les cellules peuvent également être colorées dans des volumes différents de 30 μL pour intégrer facilement cette méthodologie dans des protocoles de coloration déjà existants.
   4. Centrifuger à 350 x g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ajoutez le cocktail d’anticorps dans chaque puits et remettez en suspension avec précaution sans générer de bulles. Incuber pendant 30 min à RT dans le noir.
      note: Il est possible de colorer les échantillons à 4 °C avec des résultats similaires.
   5. Ajouter 150 μL de tampon de coloration et centrifuger à 350 x g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de PBS et acquérir des données sur un cytomètre en flux. Si les volumes de coloration sont modifiés, assurez-vous d’une dilution d’au moins 20 fois du mélange d’anticorps d’origine utilisé pour laver les anticorps en excès.
      note: Les cellules colorées peuvent être fixées dans du PBS/2 % de paraformaldéhyde, conservées au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit, puis acquises sur un cytomètre en flux le lendemain.
      prudence: Le paraformaldéhyde est nocif en cas d’ingestion et peut provoquer une irritation de la peau

2. Titrage des anticorps

REMARQUE : Le titrage des anticorps est l’étape la plus critique pour obtenir des données reproductibles de haute qualité. Le titrage des anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 et -TCR γδ suit la procédure standard par laquelle la concentration d’anticorps pour séparer de manière optimale les pics positifs et négatifs est dérivée de l’indice de coloration maximal. Les dilutions au sommet ou plus près du pic du côté ascendant de la courbe de l’indice de coloration doivent être sélectionnées (figure 1A-C). L’anticorps anti-CD4 est titré de manière à placer le pic de la population CD4 positive entre les populations CD3 simples positives et les lymphocytes T CD3⁺/CD8⁺, plus près du signal CD3 simple positif afin de mieux discriminer les populations CD8dim (lymphocytes T CD8⁺ γδ et lymphocytes T NK). Dans le même ordre d’idées, le titrage de CD56 vise à positionner les cellules NK CD56⁺ entre la population CD3⁺ et la population CD3^-.

1. Courbe d’indice de coloration maximale
   REMARQUE : Le titrage des anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 et -TCR γδ suit la procédure standard par laquelle la concentration d’anticorps pour séparer de manière optimale les pics positifs et négatifs est dérivée par une courbe d’indice de coloration maximale. Si des anticorps dirigés contre d’autres marqueurs sont ajoutés au panel, ils doivent également être titrés avec une courbe d’indice de coloration maximale.
   1. Préparez une dilution d’anticorps 2 fois supérieure en remplissant 10 puits d’une plaque de 96 puits avec 40 μL de tampon de coloration. Dans le premier puits, augmenter le volume final à 80 μL de tampon de coloration et ajouter l’anticorps d’intérêt à une concentration 4 fois supérieure à la concentration suggérée par le fabricant.
   2. Bien mélanger et transférer 40 μL dans le deuxième puits. Mélangez bien et répétez cette étape pour tous les autres puits.
   3. Colorer 10 échantillons de PBMC ou de sang total avec 30 μL des 10 différentes dilutions 2 fois différentes d’anticorps en suivant le protocole décrit ci-dessus.
   4. Acquérez des données à l’aide d’un cytomètre en flux et tracez le signal de chaque dilution (Figure 1A).
   5. Gate sur les populations négatives et positives pour chaque concentration d’anticorps. L’augmentation de la concentration d’anticorps peut conduire à un bruit de fond plus élevé. Par conséquent, redimensionnez la porte négative en conséquence.
   6. Pour chaque concentration d’anticorps, extraire des informations sur la médiane et l’écart-type de l’intensité fluorescente de la population négative et la médiane de l’intensité fluorescente de la population positive. Calculez l’indice de coloration pour chaque concentration d’anticorps à l’aide de la formule suivante : (intensité fluorescente médiane de la population positive — intensité fluorescente médiane de la population négative) ÷ (2 x écart-type de l’intensité fluorescente de la population négative) (figure 1B).
   7. Tracez l’indice de coloration en fonction de la concentration d’anticorps exprimée en fraction de la dilution de l’anticorps (p. ex., dilution de 1:10 = 0,1) et identifiez la concentration de l’anticorps avec la valeur maximale de l’indice de coloration (figure 1C).
2. Titrage des anticorps anti-CD4 et -CD56
   REMARQUE : Le titrage des anticorps anti-CD4 et -CD56 repose sur le titrage précédent des autres marqueurs dans le panel à deux fluorochromes. Pour l’anticorps anti-CD4, le titrage vise à placer le signal anti-CD4 entre le signal double CD8⁺/CD3⁺ et la population CD3 simple positive (Figure 1D).
   1. Titrer les anticorps anti-CD4 et CD56 avec une stratégie de dilution en 2 fois comme décrit précédemment, en ajoutant des concentrations supplémentaires entre les deux pour identifier finement la plage de concentration qui permet de séparer les lymphocytes T CD4⁺ et les lymphocytes NK des autres populations cellulaires.
   2. Titrer l’anticorps anti-CD4 en plaçant le signal anti-CD4 entre le double signal CD8⁺/CD3⁺ et la population CD3 simple positive (Figure 1D).
      note: Il faut veiller tout particulièrement à distinguer clairement les lymphocytes T CD4⁺ des populations de CD8⁺ faible.
   3. Titrer l’anticorps anti-CD56 en suivant une stratégie similaire au titrage des anticorps anti-CD4, en plaçant les cellules NK entre les populations CD3-négatives et CD3-positives.

3. Stratégie de contrôle

1. Identifiez les populations de cellules lymphocytaires et monocytaires et supprimez les cellules mortes et la plupart des globules rouges résiduels de l’analyse.
   1. Sélectionnez la population entière contenant des lymphocytes et des monocytes en fonction de la zone de diffusion vers l’avant ou sur le côté (FSC-A ou SSC-A). Supprimez les agrégats de cellules de l’analyse via la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la largeur de diffusion vers l’avant (FSC-H par rapport à FSC-W) et la hauteur par rapport à la largeur de diffusion latérale (SSC-H par rapport à SSC-W).
   2. Utilisez un marqueur de discrimination vivant/mort pour exclure de l’analyse les cellules mortes positives brillantes et les globules rouges résiduels. Gate sur les lymphocytes et les monocytes en fonction des différents profils FSC-A et SSC-A.
2. Stratégie de contrôle à deux fluorochromes et sept marqueurs des populations lymphocytaires.
   note: Dans le sous-groupe CD3 positif, les lymphocytes T CD4⁺, CD8⁺ et γδ peuvent être séparés à l’aide d’anticorps qui ciblent uniquement les récepteurs CD4, CD8 et γδ. De manière comparable, au sein du sous-groupe CD3 négatif, les lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes peuvent être identifiés de manière unique à l’aide d’anticorps dirigés contre CD19, CD56 et CD14, respectivement.
   1. Sélectionnez la porte lymphocytaire et créez un diagramme à points avec sur chaque axe l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole (Figure 2B).
   2. Gate sur les lymphocytes T CD8⁺ identifiés comme des lymphocytes CD3⁺/CD8⁺ doublement positifs dans le coin supérieur droit du graphique à points (figure 2B). Excluez la population de CD8 faible qui pourrait contenir des cellules NKT. Gate sur les lymphocytes T CD4⁺ identifiés comme une population entre les lymphocytes T CD8⁺ et les populations CD3 positives uniques. Porte sur les lymphocytes T γδ identifiés comme des cellules CD3 élevées. Subdivisez les lymphocytes T γδ en CD8 positifs et CD8 négatifs.
   3. Gate sur les cellules NK identifiées comme la population entre les cellules CD3 positives et CD3 négatives. Subdivisez les cellules NK en CD8 positif et CD8 négatif. Porte sur les lymphocytes B identifiés comme CD3 négatifs CD19⁺ dans le coin inférieur droit du graphique à points.
   4. Sélectionnez les portes monocytaires et créez un graphique à points avec sur chaque axe l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole (Figure 2C). Gate sur la population CD3^-/CD14⁺.

Tableau 1 : Panel d’anticorps utilisé pour la coloration à deux cellules immunitaires fluorochromes du PBMC (combinaison BV421-PE).

cible	clone	Fluorochrome	vendeur	concentration	but
CD3	UUCHT1	BV421	Bd	1/20	lignage
CD56	NCAM16.2	BV421	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Cellules mortes		L/D Bleu	Lt	1/300	Discrimination entre vifs et morts
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tableau 2 : Panel d’anticorps utilisé pour la coloration à deux cellules immunitaires fluorochromes du PBMC (combinaison APC-PE).

cible	clone	Fluorochrome	vendeur	concentration	but
CD3	UUCHT1	Apc	Bd	1/20	lignage
CD56	NCAM16.2	Apc	Bd	1/60
TCRγδ	B1	Apc	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Cellules mortes		L/D Bleu	Lt	1/300	Discrimination entre vifs et morts
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tableau 3 : Panneau d’anticorps utilisé pour colorer le PBMC congelé d’un patient atteint d’un myélome multiple.

cible	clone	Fluorochrome	catalogue	vendeur	concentration	but
CD3	UUCHT1	BV421	562426	Bd	1/20	lignage
CD56	NCAM16.2	BV421	562751	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	331217	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	555347	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	555367	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	555398	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	555413	Bd	1/300
CCR7	G043H7	AF647	353217	bio	1/30	différenciation
CD45RA	HI100	APC-H7	560674	Bd	1/60
CCR4	1G1	PE-Cy7	561034	Bd	1/60	Les sous-ensembles
CCR6	Référence G034-E3	BV605	353419	bio	1/30
CXCR3	1C6/CXCR3	AF488	Référence 561730	Bd	1/30
CD57	NK-1	PE-CF594	562488	Bd	1/900	Activation/Épuisement
HLA-DR	Référence G46-6	BV510	563083	Bd	1/30
CD16	3G8	BUV395	563784	Bd	1/30	NK, activation des monocytes
Cellules mortes		L/D Bleu	L-23105	Lt	1/300	Discrimination entre vifs et morts

Résultats

Figure 1 : Titrage représentatif des anticorps. (A) Le graphique à points montre l’expression de CD8 sur des PBMC frais colorés avec la concentration indiquée de l’anticorps. (B) Le tableau représente la médiane et l’écart-type de l’intensité fluorescente de la population CD8+, de l’intensité fluorescente médiane de la population CD8- et l’indice de coloration...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CD3	BD Biosciences	562426	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Anticorps pour la coloration Numéro d’identification de la traduction : AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Anticorps pour la coloration Numéro d’identification : AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_1089215
CCR7	Biolégende	353217	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Anticorps pour la coloration Numéro d’identification : AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	Référence 561730	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Anticorps pour la coloration Numéro de référence : AB_2744293
Cellules mortes	Technologies du vivant	L-23105	Discrimination entre vifs et morts
Plaque inférieure en V de 96 puits	Thermo-pêcheur	Référence 249570	plaque pour la coloration
Trieur de cellules FACSAria IIu	BD Biosciences		Cytomètre en flux
FCS Express 6	Logiciel De Novo		Analyse FACS
Prisme Graphpad	Logiciel GraphPad		Analyse des données