Un test de codage à barres pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules immunitaires

Abstract

Source : Baxter, R. M., et al. Analyse unicellulaire de l’immunophénotype et de la production de cytokines dans le sang total périphérique via la cytométrie de masse. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo met en évidence une méthode protéomique unicellulaire qui utilise des anticorps conjugués à des métaux lourds pour un codage à barres cellulaire distinct. Par la suite, l’immunocoloration et la cytométrie de masse sont appliquées pour évaluer les altérations immunitaires, phénotypiques et fonctionnelles dans les cellules immunitaires dérivées du sang total humain.

Protocol

1. Code-barres des cellules sanguines lysées/fixées

1. Décongelez lentement sur glace les échantillons lysés/fixes de l’entreposage à -80 °C ; un maximum de 20 échantillons peuvent être étiquetés à l’aide de codes-barres uniques et regroupés à l’aide de ce système. Diluez la mémoire tampon permanente du code-barres 10X de 1:10 avec PBS ; faire suffisamment de tampon pour ~3 mL par échantillon.
2. Remplissez une auge non stérile avec le CSM et une autre avec le tampon perm de code-barres 1X. Ajoutez 1 ml de CSM glacé aux échantillons fraîchement décongelés, mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette et transférez dans les tubes en po....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Le ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Conc de la crosse : 10 mM ; Cône final : 5 μM
R848	Invivogen	TLRL-R848-5	Conc de la crosse : 1 μg/μL ; Concentration finale : 1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Conc de la crosse : 1 μg/μL ; Concentration finale : 0,1 μg/mL
PBS stérile	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Conc d’origine : 5X ; Cône final : 1X (dilué dans ddH2O)
BD Phosflow tampon de perm/lavage I	BD biosciences	557885	Consommation d’origine : 10X ; Concentration finale : 1:10 (diluer dans ddH2O)
RPMI	Gibco	Référence 21870-076
Azoture de sodium (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Conc des actions :>99,9 %; Coût final : 0,0002
Inhibiteur du transport des protéines (ITF)	eBiosciences	Tél. : 00-4980-93	Conc d’origine : 500X ; Cône final : 1X
Intercalateur d’ADN	Fluidigm	201192B	Conc de crosse : 500 μM ; Cône final : 0,1 μM
MaxPar Barcode Perm Buffer	Fluidigm	201057	Consommation d’origine : 10X ; Cône final : 1X
Jeu de codes-barres 20-plex	Fluidigm	Réf. S0014	Conc d’origine : n/a ; Conc final : n/a
Anticorps utilisés pour la cytométrie de masse
Marqueurs de surface
CD1c	Biolégende	L161	Masse : 161
CD3	Bd	UUCHT1	Masse : 144
CD4	Biolégende	SK3	Masse : 174
CD7	Bd	M-T701	Nombre de masse : 149
CD8	Biolégende	SK1	Masse : 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Masse : 209
CD11c	Bd	B-ly6	Masse : 152
CD15	Bd	HI98	Masse : 115
CD14	Biolégende	M5E2	Masse : 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Nombre de masse : 165
CD19	Santa Cruz	Réf. SJ25C1	Masse : 163
CD21	Biolégende	Bu32	Nombre de pièces : 141
CD27	Bd	L128	Masse : 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Masse : 172
CD45 au total	Biolégende	HI30	Masse : 89
CD45RA	Biolégende	HI100	Nombre de masse : 153
CD56	Miltenyi	REA196	Masse : 168
CD66	Bd	B1.1/CD66	Masse : 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Masse : 150
CD123 (en anglais	Fluidigm	6H6	Masse : 143
CD278/ICOS	Biolégende	C398.4A	Nombre de masse : 156
CD179/PD1	Biolégende	EH12.2H7	Masse : 162
IgD	Biolégende	IA6-2	Nombre de masse : 146
Igm	Biolégende	MHM-88	Masse : 151
CXCR5	Bd	RF8B2	Masse : 173
HLADR	Biolégende	L243	Masse : 167
Cytokines
IL-1α	Biolégende	Référence 364-3B3-14	Masse : 147
IL-1β	Biolégende	N° H1b-98	Masse : 169
L’IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Masse : 157
L’IL-6	Biolégende	MQ2-13A5	Nombre de masse : 164
L’IL-8	Bd	E8N1	Masse : 160
IL-12/IL-23P40	Biolégende	C8.6	Masse : 171
L’IL-17A	Biolégende	BL168	Masse : 148
IL23P19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Masse : 176
MIP1β	Bd	Réf. D21-1351	Masse : 158
MCP1	Bd	5D3-F7	Masse : 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Masse : 175
IFNγ	Biolégende	4S.B3	Nombre de masse : 165
PTEN	Bd	A2B1	Masse : 159
TNFα	Biolégende	Mab11	Masse : 166
Remarque : Si le fabricant est indiqué comme Fluidigm, cet anticorps a été acheté auprès de Fluidigm avec du métal préconjugué. Si le fabricant est indiqué comme autre que Fluidigm, cet anticorps a été auto-conjugué à l’aide du kit d’étiquetage multi-métaux MaxPar (Fluidigm Cat : 201300) conformément au protocole du fabricant.