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1. Code-barres des cellules sanguines lysées/fixées
- Décongelez lentement sur glace les échantillons lysés/fixes de l’entreposage à -80 °C ; un maximum de 20 échantillons peuvent être étiquetés à l’aide de codes-barres uniques et regroupés à l’aide de ce système. Diluez la mémoire tampon permanente du code-barres 10X de 1:10 avec PBS ; faire suffisamment de tampon pour ~3 mL par échantillon.
- Remplissez une auge non stérile avec le CSM et une autre avec le tampon perm de code-barres 1X. Ajoutez 1 ml de CSM glacé aux échantillons fraîchement décongelés, mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette et transférez dans les tubes en polypropylène pré-étiquetés correspondants.
- Prélever un échantillon de 10 μL pour compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Normaliser le nombre de cellules à 1,5–2 x 106 cellules par échantillon dans chaque tube de grappe : retirer et jeter le volume de cellules en excès au-dessus de 2 x 106 cellules.
- Centrifugez les cellules à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon permanent 1X code-barres avec une pipette multicanaux et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le surnageant.
- Alignez les tubes du cluster sur un rack dans le même ordre que celui indiqué sur la clé du code-barres afin que l’échantillon corresponde à son code-barres. Ajoutez un tampon permanent de codage à barres 1X de 800 μL à l’aide d’une pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes en grappe sans toucher la pastille de cellule avec les pointes de la pipette (sans mélange) pour réduire la perte de cellules. Réservez le support avec les tubes de grappe.
- Retirez les barrettes de tube du kit de codage à barres 20-plex de -20 °C et décongelez-les à température ambiante. Ajoutez 100 μL de tampon permanent de code-barres 1X, mélangez soigneusement et transférez 120 μL du mélange de codes-barres remis en suspension dans les échantillons de cellules correspondants dans les tubes en grappe.
- Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux afin d’éviter toute contamination croisée entre les échantillons à code-barres individuels. Incuber les tubes en grappe pendant 30 min à température ambiante pour permettre aux codes-barres d’étiqueter les cellules.
- Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension dans 1 mL de CSM.
- Centrifuger et remettre en suspension dans CSM à nouveau.
note: Chaque échantillon est maintenant étiqueté avec un code-barres unique, et les échantillons sont prêts à être regroupés.
- Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. À l’aide d’une seule pipette et à l’aide de la même pointe, transférez toutes les pastilles de cellules d’un volume résiduel de ~70 à 80 μL dans un tube en polystyrène. N’éjectez PAS la pointe de la pipette ; Réservez la pipette unique avec cette pointe.
- À l’aide d’une pipette multicanaux et de nouvelles pointes, ajoutez ~100 μL de CSM à chaque tube en grappe d’origine pour maximiser la récupération des cellules. À l’aide de la pipette unique dont l’embout a été mis de côté, transférez toutes les pastilles de cellules d’un volume résiduel de ~100 μL dans le même tube en polystyrène.
- Ajouter du CSM pour compléter le tube de polystyrène (~3 mL). Comptez et enregistrez le numéro de cellule de l’ensemble de codes-barres regroupés. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons à code-barres le même jour.
Remarque : Il est normal de s’attendre à une perte de cellules de ~20 à 30 % dans le processus de codage à barres.
2. Coloration des cellules sanguines lysées/fixées à code-barres et préparation pour l’analyse sur un instrument de cytométrie de masse
Remarque : Chaque titre 1X d’anticorps de coloration (1 μL d’anticorps par réaction de coloration de 100 μL) peut généralement colorer 3–4 x 106 cellules. Par conséquent, lorsque tous les échantillons avec code-barres sont regroupés dans un seul tube, la quantité d’anticorps doit être augmentée. Si 20 échantillons avec code-barres représentent 30 x 106 cellules, et que chaque titre 1X peut colorer 3 à 4 x 106 cellules, l’échantillon avec code-barres ne nécessite qu’un titre de 10X, au lieu de colorer chaque échantillon individuellement, ce qui nécessiterait une quantité d’anticorps 20X (1X par tube individuel). La concentration de l’anticorps par rapport au nombre de cellules doit être soigneusement titrée pour chaque cocktail d’anticorps individuel (non discuté ici).
- Colorer les cellules à l’aide d’anticorps (Table des matériaux) pour la coloration de surface et l’induction des cytokines.
- Préparez le cocktail de coloration de surface en calculant la quantité à ajouter et en tenant compte de l’erreur de pipetage (c’est-à-dire que si vous colorez 20 échantillons à code-barres de 2 x 106 cellules dans chaque échantillon, une coloration de titre de 10X est requise ; pour les calculs de volume final, compensez l’erreur de pipetage en préparant une solution de coloration finale de 10,5X).
- Ajoutez 10 fois le volume de coloration de surface à la pastille de cellule à code-barres. Pour réduire la perte de cellules, avec la même pointe, mélangez et mesurez le volume des colorants de surface et des granules de cellules.
- En fonction du volume des cellules et du cocktail de coloration, ajouter le CSM à un volume final de coloration de 50 μL par nombre d’échantillons de cellules (c.-à-d. si vous analysez une série de 20 échantillons, 50 μL X 20 = 1 mL). Incuber pendant 30 min à 4 °C. Agiter l’échantillon toutes les 15 minutes pour favoriser une coloration uniforme.
- Pendant l’incubation de la teinture de surface, préparer le tampon Perm/Wash (Table des matériaux) en diluant 1:10 avec du ddH2O. Préparer des volumes de 2 mL pour la perméabilisation et de 5 mL pour le lavage. Conserver à 4 °C ou sur glace.
- Complétez le tube de coloration de surface avec du CSM et centrifugez-le à 600 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez le surnageant. Remettre l’échantillon à code-barres en suspension dans 2 mL de tampon Perm/Wash à dilution 1:10. Incuber à 4 °C pendant 20 à 30 min pour perméabiliser complètement les cellules.
- Centrifuger à 600 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer le surnageant.
- Pour la coloration intracellulaire, suivez des étapes de coloration similaires (comme pour la coloration de surface). Cependant, utilisez le tampon Perm/Wash à dilution 1:10 à 4 °C au lieu du CSM pour obtenir le volume total de coloration de sorte que les cellules restent dans un environnement perméabilisant tout au long de la coloration intracellulaire.
- Ajoutez le cocktail d’anticorps intracellulaires à la pastille cellulaire colorée et perméabilisée en surface (étapes 2.1.2 à 2.1.7). Porter le volume total de coloration à 50 μL par nombre d’échantillons de cellules. Incuber pendant 60 min à 4 °C. Agiter l’échantillon toutes les 15 min pour assurer une coloration uniforme.
- Lors de la coloration intracellulaire, préparer la solution intercalaire : 900 μL de PBS filtré + 100 μL de PFA filtré à 16 % (concentration finale de 1,6 % de PFA) + 0,2 μL de 500 uM de colorant intercalateur (Table des matériaux).
- Complétez le cocktail de pastilles cellulaires + d’anticorps intracellulaires avec un tampon Perm/Wash 1:10 froid.
- Centrifuger à 600 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer le surnageant. Complétez le tube de coloration avec du CSM. Comptez et notez le numéro de portable. Centrifuger à 600 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de solution d’intercalateur à partir de l’étape 4.9. Incuber pendant au moins 20 minutes à température ambiante pour une intercalation complète ou toute la nuit à 4 °C (les échantillons en solution intercalaire peuvent rester à 4 °C jusqu’à 1 semaine avant d’être analysés sur l’instrument de cytométrie de masse).
- Préparez les cellules pour l’instrument de cytométrie de masse.
- Remplissez le tube avec 3 mL de ddH2O filtré et centrifugez à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez les cellules en suspension dans 3 mL de ddH2O filtré. Faites passer cette suspension à travers un filtre de 100 μm pour éliminer tous les débris ou agrégats qui pourraient potentiellement obstruer l’instrument de cytométrie de masse.
- Comptez et enregistrez le numéro de cellule après la filtration. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C
- Préparez la solution de billes d’étalonnage (Table des matériaux) en la diluant 1:10 dans du ddH2O filtré.
- Remettre en suspension les cellules colorées dans le volume requis de solution de billes d’étalonnage diluées 1:10 pour atteindre une concentration cellulaire de ~1 x 106 cellules/mL.
note: Pour un CyTOF1 à 45 μL/min, l’optimum recommandé est de 5 x 105 cellules/mL ; pour Helios à 30 μL/min, 7,5 x 105 cellules/mL.
- Procédez à l’analyse de l’échantillon sur l’instrument de cytométrie de masse.