Utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour évaluer les forces des récepteurs appliquées par les cellules immunitaires

Résumé

Source : Ma, R. et al., DNA Sondes de tension pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires. J. Vis. Exp.(2021)

La vidéo présente une méthode d’évaluation des forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires à l’aide de nanoparticules d’or ancrées au polyéthylène glycol et de sondes de tension en épingle à cheveux d’ADN. Les interactions des lymphocytes T CD8-positifs déclenchent le dépliage de la sonde, émettant une fluorescence tandis que les brins verrouillables maintiennent le signal pour quantifier les forces appliquées par les cellules immunitaires.

Protocole

1. Préparation des oligonucléotides

1. Dissoudre le ligand de l’acide désoxyribonucléique (ADN) dans l’eau (résistivité de 18,2 MΩ, utilisée tout au long du protocole). Vortex et faites tourner la solution avec une centrifugeuse de table. Régler le volume d’eau de manière à ce que la concentration finale soit de 1 mM. Valider la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre à nanogouttes pour mesurer l’absorbance à 260 nm et déterminer la concentration finale en fonction du coefficient d’extinction de l’oligonucléotide.
   note: Le brin du ligand présente une modification à chaque extrémité, 5' amine et 3' de biotine, pour se conjuguer avec le fluorophore et présenter le ligand biotinylé. Le groupe amine dans le brin ligand doit être conjugué avec un fluorophore. Le colorant Cy3B est utilisé pour cette conjugaison en raison de sa luminosité et de sa photostabilité élevées, mais il n’est généralement pas proposé dans le commerce et nécessite une conjugaison en interne. En conséquence, la section suivante décrit la conjugaison entre les amines et les colorants esters de N-hydroxysuccinimide (NHS). Pour les utilisateurs finaux qui n’ont pas accès aux installations ou aux ressources nécessaires à la modification des acides nucléiques, les acides nucléiques modifiés peuvent être achetés auprès de fournisseurs de synthèse d’ADN personnalisés qui proposent des colorants brillants et photostables, tels que la famille de colorants Alexa et Atto.
2. Préparez 10 solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) et 1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO₃). Mélanger 10 μL de la solution de ligand d’amine 1 mM (10 nmol) avec 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO₃ et 60 μL de H₂O. Dissoudre 50 μg de N-hydroxysuccinimide Cy3B (ester NHS) dans 10 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) immédiatement avant utilisation et ajouter au mélange pour un volume de réaction total de 100 μL. Ajouter l’ester Cy3B NHS dernier. Laisser réagir à température ambiante pendant 1 h ou 4 °C pendant la nuit.
3. Préparez le brin de verrouillage Atto647N en conjuguant le brin de verrouillage amine avec l’ester NHS Atto647N. Préparez 10 solutions de PBS et 1 M de NaHCO₃. Mélanger 10 μL de la solution de brin bloquant d’amine 1 mM (10 nmol) avec 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO₃ et 60 μL de H₂O. Dissoudre 50 μg d’ester NHS Atto647N dans 10 μL de DMSO immédiatement avant utilisation et ajouter au mélange pour un volume de réaction total de 100 μL. Ajouter l’ester NHS Atto647N en dernier. Laisser réagir à température ambiante pendant 1 h ou 4 °C pendant la nuit.
4. Après les réactions, éliminer les sous-produits, l’excès de colorant et les sels par filtration sur gel de dessalage P2. Diluer le mélange réactionnel avec du H₂O jusqu’à un volume total de 300 μL, ce qui convient à l’étape de purification ultérieure par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Ajoutez 650 μL de gel P2 hydraté dans un appareil centrifuge et faites tourner à 18 000 x g pendant 1 min. Retirez le liquide au bas de l’appareil, ajoutez le mélange réactionnel dans la colonne contenant le gel P2, tournez à 18 000 x g pendant 1 min et récupérez le mélange réactionnel au bas de l’appareil.
   note: Le gel P2 doit être hydraté au moins 4 h avant d’être utilisé avec_H2O.
5. Purifier le mélange réactionnel dessalé à l’aide d’une colonne C18 destinée à la purification des oligonucléotides, avec du solvant A : 0,1 M d’acétate de triéthylammonium (TEAA) dans H₂O et B : acétonitrile (ACN) comme phase mobile pour une élution à gradient linéaire 10-100 % B sur 50 min à un débit de 0,5 mL/min. Injecter le mélange réactionnel dessalé dans la HPLC en phase inverse avec une boucle d’injection de 500 μL pour la purification. Prélever le produit qui a un pic d’absorbance pour l’acide désoxyribonucléique, l’ADN (260 nm) et un pic d’absorbance pour le fluorophore (560 nm pour Cy3B et 647 nm pour Atto647N) et les sécher dans un concentrateur centrifuge sous vide pendant la nuit (voir Figure 1A).
6. Reconstituer le produit oligocolorant séché dans 100 μL d’eau. Déterminez la concentration du brin du ligand Cy3B et du brin verrouillable Atto647N à l’aide du spectrophotomètre à nanogouttes. Assurez-vous que le rapport d’étiquetage du colorant est proche de 1:1. Corriger l’absorbance de 260 nm du colorant si nécessaire lors de la détermination de la concentration en oligonucléotides.
7. Valider le produit purifié à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF-MS) en utilisant le 3-hydroxypropionaldéhyde (3-HPA) comme substrat dans 50 % d’ACN/H₂O avec 0,1 % d’acide trifluoracétique (TFA) et 5 mg/mL de citrate d’ammonium en utilisant 0,5 μL du produit à 1-5 μM pour la préparation d’échantillons MALDI-TOF-MS. Un exemple de spectre de masse peut être trouvé dans la figure 1B.
8. Dissoudre le brin en épingle à cheveux et le brin d’ancrage dans l’eau et s’assurer que la concentration des solutions mères est comprise entre 50 et 100 μM.
   note: Le brin d’épingle à cheveux n’est pas modifié et peut être directement synthétisé sur mesure auprès d’un fournisseur. Le brin d’ancrage a un groupe d’ancrage thiol et un quencher BHQ2 et peut être synthétisé directement sur mesure par un fournisseur.
9. Aliquote de tous les oligonucléotides. Pour une utilisation et un stockage à court terme, stockez ces oligonucléotides à 4 °C. Pour un stockage à long terme, congelez-les et conservez-les à -20 °C. À ce stade, tous les oligonucléotides sont prêts pour l’assemblage de la sonde de tension de l’ADN.
   note: Les cycles répétés de gel-dégel ne posent pas de problème pour les oligonucléotides.

2. Préparation de surface

REMARQUE : La préparation des substrats de sonde de tension en épingle à cheveux d’ADN prend deux jours. La sonde de tension en épingle à cheveux d’ADN sera fonctionnalisée sur des lamelles en verre.

1. Jour 1
   1. Placez les lamelles de 25 mm sur une grille en polytétrafluoroéthylène dans un bécher de 50 ml. Chaque support peut contenir jusqu’à 8 lamelles. Rincez les lamelles en les immergeant trois fois dans l’eau.
   2. Ajouter 40 mL d’une solution d’éthanol dans un rapport de 1:1 (v :v) mélangée à de l’eau dans le bécher contenant la grille et les lamelles, et sceller le bécher à l’aide d’une pellicule de paraffine.
   3. Soniquer le bécher pendant 15 min dans un nettoyeur à ultrasons (fréquence de fonctionnement 35 KHz) pour nettoyer les lamelles. Après la sonication, jetez le liquide et rincez le bécher avec la grille et les lamelles à l’eau au moins 6 fois pour éliminer tout solvant organique restant.
   4. Préparez une solution fraîche de Piranha en mélangeant de l’acide sulfurique et du peroxyde d’hydrogène dans un rapport de 3:1. Pour préparer 40 ml de solution de Piranha, ajoutez d’abord 30 ml d’acide sulfurique dans un bécher propre de 50 ml, puis ajoutez lentement 10 ml de peroxyde d’hydrogène, H₂O₂. La solution Piranha va rapidement chauffer et bouillonner lors de l’ajout du H₂O₂. Mélangez délicatement le piranha à l’aide de l’extrémité d’une pipette en verre.
   5. Ensuite, transférez la grille qui maintient les lamelles dans le bécher contenant une solution de Piranha légèrement mélangée pour la gravure (Figure 2A). Laissez la solution de Piranha s’hydroxyler et nettoyez les lamelles pendant 30 minutes à température ambiante. Après la gravure Piranha, transférez la grille à l’aide d’une pince à épiler en acier ou en polytétrafluoroéthylène dans un bécher propre de 50 ml avec de l’eau et rincez à nouveau à l’eau au moins 6 fois.
      prudence: De grandes quantités de substances organiques pourraient réagir vigoureusement avec la solution de Piranha et provoquer une explosion. Soyez prudent et travaillez toujours avec la solution Piranha dans une hotte. Assurez-vous de porter une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité. Ne conservez jamais la solution fraîche de Piranha dans un récipient hermétique.
      note: Le rapport peroxyde d’hydrogène/acide sulfurique doit être inférieur à 1:2 (v :v) et ne doit jamais dépasser 1:1. Lorsque vous immergez le support avec des lamelles dans une solution Piranha, placez-les dans la solution lentement et soigneusement. Ne jetez pas la solution immédiatement après la gravure, car elle est encore active et chaude. Laissez-le dans le bécher toute la nuit avant de le verser dans le récipient à déchets acides.
   6. Immergez la grille contenant les lamelles dans un bécher de 50 ml avec 40 ml d’éthanol pour éliminer l’eau. Jetez l’éthanol et répétez l’opération 3 fois pour vous assurer que l’eau a été éliminée.
   7. Immergez ensuite la grille dans du triéthoxysilane aminopropylique à 3 % (APTES) (v/v) dans 40 mL d’éthanol pour réagir avec le -OH sur les lamelles pendant 1 h à température ambiante (Figure 2B).
      note: L’éthanol peut être remplacé par de l’acétone.
   8. Rincer 6 fois les surfaces en les immergeant dans 40 mL d’éthanol, puis les faire sécher au four à 80 °C pendant 20 min. Après refroidissement, conservez les lamelles séchées modifiées aux amines à -20 °C pour une utilisation future (jusqu’à 6 mois).
   9. Couvrez la face intérieure inférieure des boîtes de Pétri en plastique de 10 cm de diamètre avec un film de paraffine. Le film de paraffine empêche les lamelles de glisser à l’intérieur de la boîte de Pétri et aide à conserver la solution pour les prochaines étapes de fonctionnalisation sur les lamelles. Placez les lamelles modifiées aux amines refroidies dans les boîtes de Pétri. Le côté à fonctionnaliser doit être tourné vers le haut.
   10. Pour modifier les groupes amines sur les lamelles, ajouter 300 μL de poly(éthylène glycol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) d’acide lipoïque à 0,5 % p/v (mPEG-SC) dans 0,1 M de NaHCO₃ sur chaque lamelle et incuber pendant 1 h à température ambiante (figure 2C). Pour chaque lamelle de 25 mm, peser 1,5 mg de LA-PEG-SC et 7,5 mg de mPEG-SC. Dissoudre les réactifs NHS immédiatement avant de les ajouter aux surfaces, car ils ont une courte demi-vie (~10 min) dans une solution aqueuse à température ambiante. Après la réaction, rincez les surfaces 3 fois à l’eau.
       note: La réaction NHS peut être effectuée à 4 °C pendant la nuit. Les réactifs NHS ont une demi-vie plus longue avant l’hydrolyse à 4 °C, soit environ 4 à 6 h. Cela se traduira par une procédure de préparation de surface de trois jours.
   11. Ajouter 100 μL de bicarbonate de sodium 0,1 M, NaHCO₃ contenant 1 mg/mL d’acétate de sulfo-NHS à un ensemble de lamelles « sandwich » (deux lamelles se faisant face l’une vers l’autre avec un tampon de réaction entre les deux). Laisser la passivation se produire pendant au moins 30 min. Pour économiser le réactif, cette étape pourrait être effectuée avec 50 μL d’acétate de sulfo-NHS à 1 mg/mL. Rincer à l’eau trois fois après la passivation.
   12. Ajouter 0,5 mL de nanoparticules d’or (AuNP, 8,8 nm, acide tannique, 0,05 mg/mL) à chaque lamelle et incuber pendant 30 min à température ambiante (figure 2D). Pour économiser le réactif, cette étape peut être effectuée en prenant également en sandwich deux lamelles. Assurez-vous qu’aucun sel n’est présent dans le système des étapes précédentes pour éviter l’agrégation de nanoparticules d’or. Ne laissez pas les lamelles sécher après cette étape.
   13. Pendant ce temps, pré-hybridez l’épingle à cheveux 4,7 pN, le brin ligand Cy3B et le brin d’ancrage BHQ2 qui forment les sondes de tension ADN construites à un rapport de 1,1:1:1 dans 1 M de chlorure de sodium (NaCl) à 300 nM dans un tube d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). Recuire les brins en chauffant la solution à 95 °C pendant 5 min, puis refroidir progressivement en baissant la température à 20 °C pendant 30 min dans un thermocycleur.
   14. Rincez les lamelles à l’eau trois fois après 30 min d’incubation avec des nanoparticules d’or. Ajoutez un brin d’ancrage BHQ2 supplémentaire (à partir d’un stock de 100 μM) à la solution d’ADN recuit pour obtenir un rapport de 10:1 entre le brin d’ancrage BHQ2 et le brin de ligand Cy3B. À ce stade, la solution d’ADN doit contenir 300 nM de sonde de tension et 2,7 μM de brin BHQ2. Ajouter 100 μL par deux lamelles pour faire le « sandwich » (figure 2E).
   15. Placez soigneusement une boule de tissu de laboratoire humide dans la boîte de Pétri (à l’écart des lamelles) et scellez la boîte avec un film de paraffine pour éviter que la solution ne se dessèche. Couvrir le plat de papier d’aluminium et incuber à 4 °C pendant la nuit.
2. Jour 2
   1. Lavez les sondes en excès des lamelles avec 1x PBS. Vérifiez la qualité de surface de la sonde de tension d’ADN au microscope épifluorescent.
   2. Préparez 40 μg/mL de streptavidine dans 1x PBS et incubez sur des lamelles pendant 30 min à température ambiante (figure 2F). Habituellement, 100 μL suffisent pour une lamelle de 25 mm. Rincer avec du PBS 3 fois après l’incubation pour éliminer l’excès de streptavidine.
   3. Préparez 40 μg/mL d’anticorps/ligand biotinylé dans 1x PBS. Ajouter 50 à 100 μL par sandwich et incuber pendant 30 minutes à température ambiante (figure 2G). Rincer avec du PBS trois fois après l’incubation pour éliminer l’excès d’anticorps/ligand biotinylé.
   4. Assemblez soigneusement les chambres d’imagerie propres avec les surfaces. Les surfaces peuvent être facilement fissurées lors du serrage des chambres. Ajoutez 0,5 à 1 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans les chambres d'imagerie et maintenez-les prêtes pour l'imagerie avec des cellules (Figure 2H).

3. Imagerie des forces des récepteurs cellulaires

1. Préparer les cellules immunitaires d’intérêt dans HBSS à 1-2 x 10⁶ cellules/mL.
   note: Les cellules naïves de CD8+ OT-1 sont utilisées à titre d’exemple dans cet article. Purifiez les lymphocytes T naïfs CD8⁺ OT-1 de la rate de souris sacrifiées à l'aide du kit d'isolement de lymphocytes T CD8⁺ de souris MACS avec un séparateur de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) en suivant les instructions du fabricant. Isolez et enrichissez les lymphocytes T CD8⁺ en retirant tous les lymphocytes T non CD8+ auxquels se lie le cocktail d’anticorps appauvrissant le magnétisme. Remettre en suspension les lymphocytes T naïfs OT-1 CD8+ purifiés dans HBSS à raison de 2 x 10⁶ cellules/mL et les maintenir sur glace avant utilisation.
2. Vérifiez la qualité de la surface de la sonde de tension en épingle à cheveux de l’ADN au microscope à fluorescence (objectif 100x) pour le contrôle de la qualité avant d’ajouter des ligands ou de plaquer des cellules. Imagez et quantifiez l’intensité moyenne du bruit de fond dans le canal Cy3B de la surface d’une sonde de tension en épingle à cheveux d’ADN à partir d’au moins 5 positions différentes et 3 répétitions. Maintenir les conditions d’acquisition d’imagerie cohérentes afin que cette valeur puisse être utilisée comme marqueur fiable de la qualité de surface et de la densité de la sonde (Figure 3C).
   note: Quantifier le nombre de brins d’ADN par nanoparticule d’or et le nombre de nanoparticules d’or par μm² les premières fois de la préparation de surface selon la littérature, ce qui peut être utilisé comme un autre marqueur fiable de la qualité de surface.
3. Plaquez ~4 x 10⁴ - 10 x 10 4 cellules sur chaque lamelle fonctionnalisée de sonde de tension d’ADN et laissez-les se fixer et s’étaler pendant ~15 min à température ambiante.
4. Au fur et à mesure que les cellules sont plaquées sur les sondes de tension en épingle à cheveux de l’ADN et commencent à se propager, imagez les signaux de fluorescence générés dans le canal Cy3B avec l’objectif 100x (Figure 2I).
5. Une fois que les cellules ont commencé à produire un signal de tension en temps réel sur la surface de la sonde de tension en épingle à cheveux de l’ADN dans le canal Cy3B, acquérez des images dans les canaux Cy3B et Atto647N (la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) donne un meilleur rapport signal/bruit que l’épifluorescence). Par la suite, ajouter le brin Atto647N dans les chambres d’imagerie à une concentration finale de 200 nM pour une hybridation sélective mécanique.
6. Après 10 min d'incubation, retirez rapidement et délicatement le tampon contenant le brin de verrouillage fluorescent Atto647N et remplacez-le par des sels équilibrés frais de Hank. Imagez à nouveau dans les canaux Cy3B et Atto647N et déterminez le coefficient de corrélation de Pearson avec le logiciel Fiji.
7. Au point temporel d’intérêt pour l’étude, introduire un brin de verrouillage non fluorescent dans les cellules de la chambre d’imagerie pour stocker le signal de tension. Préparez un stock de brins verrouillables (100 μM) et ajoutez-le aux cellules à une concentration finale de 1 μM. Pipetez doucement pour mélanger. La durée de verrouillage peut varier, mais 10 min est le temps recommandé.
8. Acquérir des vidéos en accéléré ou des images finales en épifluorescence pour la cartographie qualitative de la tension et l’analyse quantitative si nécessaire (Figure 2J et Figure 4).
   note: Si vous souhaitez mesurer la tension à plusieurs points temporels, lancez l’effacement des signaux de tension stockés par l’ajout d’un brin de déverrouillage. Pour éviter un rinçage excessif, une concentration finale plus élevée du brin de déverrouillage à 2 μM est utilisée pour initier une réaction de déplacement du brin médiée par le pied avec le brin de verrouillage pendant 3 min, ce qui efface les signaux stockés (Figure 2J). Rincez doucement les oligonucléotides en excès avec HBSS. L’ADN sonde la tension en épingle à cheveux fait surface et les cellules sont prêtes pour une autre série de stockage et de cartographie de la tension. Il n’est pas nécessaire de déverrouiller les signaux de tension si un seul point temporel est intéressant dans l’étude.

Résultats

Figure 1 : Exemples de préparation d’oligonucléotides.(A) chromatogramme HPLC de la purification du ligand Cy3B ; b) les spectres MALDI-TOF-MS du produit ; (C) Tableau de la masse calculée et des pics m/z trouvés du matériau de départ et de l’oligonucléotide marqué.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 3-hydroxypicolinique (3-HPA)	sigma	Référence 56197	Matrice Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	Préparation de surface
(3-aminopropyl)triéthoxysilane	Acros	AC430941000	Préparation de surface
10x tampon de lyse des globules rouges	Biolégende	Tél. : 00-4333-57	tampon
Nanoparticules d’or de 8,8 nm, acide tannique	Nanocomposix	commande sur mesure	Préparation de surface
Atto647N NHS ester	sigma	18373-1MG-F	Fluorophore, préparation oligo
Chambre cellulaire Attofluor, pour la microscopie	Thermo Fisher Scientific	A7816	imagerie
Seringues BD uniquement avec Luer-Lok	BD biosciences	309657	Cellules
CD3e anti-souris biotinylé	Ebioscience	Référence 13-0031-82	Anticorps/ligand
Ovalbumine pMHC biotinylée (SIINFEKL)	Plateforme de tétramère des NIH à l’Université Emory	Na	Anticorps/ligand
Albumine sérique bovine	sigma	735078001	Bloquer les interactions non spécifiques
Crépines cellulaires	Biologix	15 à 1100	Cellules
Mini-porte-bagages en téflon	Thermo Fisher Scientific	Réf. C14784	Préparation de surface
Ester Cy3B NHS	GE Soins de santé	PA63101	Fluorophore, préparation oligo
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Corning	Référence 21-031-CM	tampon
éthanol	sigma	459836	Préparation de surface
Sels équilibrés de Hank (HBSS)	sigma	N° H8264	tampon
Peroxyde d’hydrogène	sigma	N° H1009	Préparation de surface
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3,4 K	Préparation de surface
Kit de démarrage Midi MACS (LS)	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-301	Cellules
Kit d’isolement de lymphocytes T CD8+ de souris	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-104-075	Cellules
Dispositifs centrifuges Nanosep MF	Laboratoire Pall	ODM02C35	Préparation oligo
N° 2 lamelles rondes en verre	VWR	Référence 48382-085	Préparation de surface
NTA-SAM	Dojindo Technologies moléculaires	N475-10	Préparation de surface
Gel P2	Bio-rad	1504118	Préparation oligo
acide sulfurique	EMD Millipore Corporation	Réf. SX1244-6	Préparation de surface
Acétate Sulfo-NHS	Thermo Fisher Scientific	Référence 26777	Préparation de surface
équipement
Agilent AdvanceBio Oligonucléotide C18 colonne, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	Référence 653950-702		Préparation d’oligonucléotides
Système de purification d’eau Barnstead Nanopure	Thermo Fisher		Eau
Objectif CFI Apo 100× NA 1.49	Nikon		microscopie
Cube Cy5	Chroma		microscopie
Dispositif à coupleur de charge multiplicatrice d’électrons Evolve (EMCCD)	Photométrie		microscopie
Chromatographie liquide à haute performance	Agilent 1100		Préparation d’oligonucléotides
Source d’épifluorescence Intensilight	Nikon		microscopie
Spectromètre de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assisté par matrice (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Préparation d’oligonucléotides
Spectrophotomètre UV-Vis Nanodrop 2000	Thermo Fisher		Préparation d’oligonucléotides
Microscope inversé Nikon Eclipse Ti	Nikon		microscopie
Système de mise au point parfaite Nikon	Nikon		microscopie
Logiciel NIS Elements	Nikon		microscopie
Quadribande TIRF 405/488/561/647 cube	Chroma		microscopie
Cube RICM	Chroma		microscopie
Lanceur TIRF de 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) et 640 nm	cohérent		microscopie
Cube TRITC	Chroma		microscopie
Nom de l’oligo	Modification 5' / Modification 3'	Séquence (5' à 3')	utiliser
Fil de verrouillage à l’amine 15MER	Modification 5' : pas de modification Modification 3' : /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Verrouillage du signal de tension en temps réel
15mer Atto647N brin de verrouillage	Modification 5' : Atto647N Modification 3' : /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Verrouillage du signal de tension en temps réel
15MER non fluorescent brin de verrouillage	Modification 5' : pas de modification Modification 3' : aucune modification	A AAA AAC ATT TAT AC	Verrouillage du signal de tension en temps réel pour l’analyse quantitative
4,7 brins d’épingle à cheveux pN	Modification 5' : pas de modification Modification 3' : aucune modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC L’ACCG	Sonde en épingle à cheveux
Ligand d’amine	Modification 5' : /5AmMC6/ 3' modification : /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonde en épingle à cheveux
Cordon d’ancrage BHQ2	Modification 5' : /5ThiolMC6-D/ 3' modification : /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Sonde en épingle à cheveux
Ligand Cy3B	Modification 5' : Cy3B 3' modification : /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonde en épingle à cheveux
Dégagement du brin	Modification 5' : pas de modification Modification 3' : aucune modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Déverrouillage du signal de tension accumulé