Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des stocks et stockage du CFSE
- Préparez un stock de 5 mM de 5- et 6-carboxyfluorescéine diacétate succinimidylique ester (CFSE) dans du diméthylsulfoxyde. Tourbillon. Versez 100 μl d’aliquotes dans des microtubes stériles à bouchon à vis de 0,5 ml. Stocker les aliquotes à -80 °C.
2. Souris
- Utilisez des souris consanguines mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines. Les animaux du même sexe et de l’âge sont préférés. Assurez-vous que les permis éthiques nécessaires pour les animaux sont en place avant le début des expériences.
3. Immobilisation des animaux avec une anesthésie au gaz isoflurane
- Chargez l’appareil d’anesthésie avec de l’isoflurane. Remplissez la seringue en verre étanche au gaz de 10 ml avec de l’isoflurane. Évitez d’introduire des bulles d’air. Connectez la seringue et l’entrée de liquide avec le tube fourni et déplacez le poussoir vers l’avant jusqu’à ce que le liquide dans le tube de raccordement soit visiblement sur le point d’entrer dans le vaporisateur.
note: Ne stockez pas l’isoflurane dans la seringue lorsqu’elle n’est pas utilisée.
- Anesthésier les animaux avec de l’isoflurane dans la chambre d’induction, avec un débit d’air maintenu à environ 400 - 500 ml/min et une concentration d’isoflurane à 3,5 %.
note: L’unité ne fonctionnera pas sans flux d’air.
- Une fois que les animaux sont endormis, tournez le robinet d’arrêt de l’appareil d’anesthésie pour acheminer le gaz isoflurane vers la pièce du masque. Vérifiez que la pièce du masque est intacte pour éviter les fuites de gaz. Le débit d’air peut être maintenu à 400 ml/min, ou réduit à 200 ml/min. Réduire la concentration d’isoflurane à 2,6 %.
note: L’effet anesthésique peut être augmenté et/ou diminué en ajustant le débit.
4. Injections et récupération du BCG
- Confirmez visuellement et effectuez des tests tels que le test du réflexe de pincement des orteils pour vous assurer que les souris sont immobilisées/endormies sur le morceau du masque à l’isoflurane avant d’effectuer les injections.
- Inoculer dans le coussinet de la patte postérieure, 1 x 106 Unités formant colonies de Mycobacterium bovis Bacille de Calmette-Guérin (BCG) dans 30 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 29 G x 1/2 pouce.
note: La génération de stocks mycobactériens est brièvement décrite dans la description originale de cette procédure, et en détail ailleurs. Le BCG est également facilement disponible auprès de sources commerciales. Les auteurs recommandent que le BCG soit pulsément soniqué ou passé dans une seringue pour perturber les amas avant son inoculation chez la souris. Le BCG est réitéré ici en tant que stimulus microbien, étant donné son emploi dans la description originale de ce protocole 3, mais les auteurs encouragent certainement l’essai d’autres stimuli microbiens.
- Effectuez la même procédure que celle décrite ci-dessus pour l’injection de PBS chez les souris témoins.
- Surveiller les animaux après les injections pour confirmer que la récupération de l’anesthésie est réussie et que les animaux peuvent se soutenir sur le coussinet plantaire postérieur injecté.
5. Injections CFSE
- Préparation du CFSE pour les injections
- Décongeler un flacon de 5 mM de solution mère CFSE à -80 °C. Diluer le CFSE 10 fois dans du PBS. Remettez la solution en suspension avant de remplir la seringue en préparation de l’injection.
- CFSE Injection et récupération
- Répétez la procédure d’anesthésie des animaux à la section 3. Injecter 20 μl de 0,5 mM CFSE dans le coussinet plantaire postérieur qui a précédemment reçu BCG ou PBS.
note: L’injection de CFSE doit être effectuée la veille (24 heures) de la date prévue pour le sacrifice.
6. Ablation chirurgicale du ganglion lymphatique poplité (pLN)
NOTE : L’utilisation d’instruments chirurgicaux stérilisés et leur décontamination répétée à l’éthanol à 70 % sont encouragées tout au long de cette étape.
- Euthanasier les souris. Vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Épingler l’animal en position dorsale, sur une planche de dissection.
note: Les auteurs peuvent recommander l’euthanasie par luxation cervicale.
- Faites soigneusement une incision verticale dans la cuisse arrière. Dégagez les muscles et la graisse à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler pour exposer et par conséquent exciser le pLN situé profondément dans la poche graisseuse, au creux du genou.
- Transférez le pLN dans 0,5 ml de PBS stérile, sur de la glace.
7. Génération de suspension unicellulaire à partir de pLN
- Homogénéiser le pLN à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns placée dans une plaque à 6 puits contenant 5 ml de PBS ou de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (PBS contenant 2 % de sérum de veau fœtal (SCF), 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 1 mM d’azoture de sodium). Homogénéiser à travers la passoire à l’aide de l’extrémité arrière d’une seringue de 3 ml.
note: L’azoture de sodium est toxique et doit être manipulé avec prudence.
- Lavez la passoire avec 5 ml supplémentaires de tampon PBS ou FACS, collectez le matériau dans un tube de 15 ml et granulez les cellules à 277 x g (1 200 tr/min, R = 172 mm) pendant 5 min, 4 °C. Vous pouvez également homogénéiser les pLNs directement dans des tubes de microcentrifugation à l’aide d’homogénéisateurs en polypropylène.
- En fonction de la taille des pastilles, remettre la suspension pLN dans un volume approprié de tampon PBS ou FACS, par exemple 200 à 1 000 μl. Utilisez une chambre de comptage pour quantifier le nombre total de cellules obtenu à partir de chaque suspension LN. Utilisez du bleu trypan pour exclure les cellules mortes/mourantes.
8. Coloration cellulaire et cytométrie en flux
- Transférez 1 - 10 x 106 cellules dans des tubes en polystyrène à fond rond de 5 ml. Lavage avec tampon FACS et granulés par centrifugation à 277 x g (1 200 tr/min, R= 172 mm) pendant 5 min, 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 50 à 100 μl d’un cocktail d’anticorps (voir marqueurs de cellules dendritiques [DC] utilisés pour la coloration de surface, tableau des matériaux) contenant 0,5 à 1 μg d’anti-souris CD16/CD32 (pour bloquer les interactions non spécifiques médiées par Fc) dans un tampon FACS pendant 30 à 45 min, sur de la glace. Protégez les échantillons de la lumière.
- Après l’incubation, laver les cellules avec un tampon FACS et des granulés par centrifugation à 277 x g (1 200 tr/min, R = 172 mm) pendant 5 min, 4 °C.
- Remettre les cellules en suspension dans 50 à 100 μl de tampon FACS. Acquérir des données sur un cytomètre en flux.
