Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. A. fumigatus Culture et conditions
- Préparez le milieu gélosé au glucose minimal comme décrit.
- Ajuster le milieu à un pH de 6,5 à l’aide de 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) et d’un autoclave à 120 °C pendant 20 min.
- Laisser refroidir à 65 °C.
- En travaillant dans une hotte à écoulement stérile, versez 30 ml de milieu refroidi dans un ballon T75 et laissez-le refroidir avec le col du ballon reposant sur une pipette de 25 ml pour créer une pente de gélose.
- Égrainez la souche dsRed Af293-Aspergillus fumigatus sur la gélose et incubez pendant 7 jours à 37 °C + 5 % de dioxyde de carbone (CO2). Deux flacons produiront environ 10à 9 conidies dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 5 mL avant la biotinylation.
2. A. fumigatus Étiquetage et préparation
REMARQUE : Lors de la première réalisation de ce test, préparez la souche parentale Af293-A. fumigatus. Prélever des échantillons des deux souches dans des tubes de microcentrifugation et étiqueter un seul exemplaire de chaque souche, comme décrit ci-dessous. Cela permettra d’avoir des conidies de contrôle sans couleur et des conidies avec une seule couleur, soit dsRed ou Alexa Fluor 633 (AF633), pour tester la configuration et l’équipement.
- Récoltez les conidies d’A. fumigatus en immergeant la culture avec 30 mL de PBS + 0,05 % de Tween-80. Filtrer la suspension résultante à travers une crépine de 40 μm dans un tube de 50 mL pour éliminer les fragments d’hyphes.
- Centrifuger à 805 x g pendant 10 min, retirer le surnageant et laver une fois dans 20 mL de PBS stérile. Accumulez des conidies à partir de deux plaques de la même souche pendant l’étape de lavage.
- Après l’étape de lavage, remettre la pastille en suspension dans 5 mL de PBS et transférer 1 mL d’aliquotes de suspension conidique dans des tubes de microcentrifugation. 1 mL de suspension de chaque souche est généralement suffisant pour l’imagerie de cellules vivantes. Enveloppez les aliquotes restantes dans du papier d’aluminium et conservez-les à 4 °C.
- Centrifuger les aliquotes de suspension conidiale à 9 300 x g pendant 10 min à température ambiante et éliminer soigneusement le surnageant. Remettre en suspension la pastille de conidiaure dans 1 mL de bicarbonate de sodium 0,05 M (NaHCO3) pH 8,3.
- Préparez une solution mère de 10 mg de biotine/200 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) en reconstituant 25 mg de biotine dans 500 μL de DMSO. Ajouter 10 μL de solution mère de biotine/DMSO dans le tube de microcentrifugation, le recouvrir de papier d’aluminium et incuber pendant 2 h sur une bascule à 4 °C.
- Aliquote le reste de la solution mère de biotine/DMSO et congèlez-le à -20 °C pour l’utiliser dans des expériences ultérieures.
- Centrifugez pendant 10 min à 9 300 x g et retirez soigneusement le surnageant. Remettre la pastille conidique en suspension dans 1 mL de 100 mM de chlorhydrate de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris-HCl) pH 8,0 pendant 1 h pour désactiver la biotine flottante.
- Centrifugez pendant 10 min à 9 300 x g et retirez soigneusement le surnageant. Lavez la pastille deux fois avec 1 mL de PBS stérile et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de PBS.
- Dissoudre 1 mg de streptavidine-AF633 dans 0,5 mL de PBS pour obtenir une solution mère à 2 mg/mL. Ajouter 10 μL de streptavidine-AF633 à 2 mg/mL par 1 mL de suspension conidique et incuber pendant 40 minutes à température ambiante sur une bascule recouverte de papier d’aluminium. Le reste de la streptavidine-AF633 peut être congelé dans des aliquotes pour être utilisé dans des expériences ultérieures.
- Centrifugez pendant 10 min à 9 300 x g et retirez soigneusement le surnageant. Remettre la culot conidique en suspension dans 1 mL de PBS et compter les conidies à l’aide d’un hémocytomètre à une dilution de 1:1 000 (1:100 puis 1:10). Ajuster la concentration conidique à 3,6 x 106/mL avec un support indépendant du CO2, envelopper dans une feuille d’aluminium et conserver à 4 °C
note: Les conidies sont maintenant étiquetées avec AF633 et seront appelées conidies FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE).
- Facultatif : Si une stimulation avec des conidies enflées est nécessaire, après avoir compté les conidies (étape 2.9), diluez les conidies à 7,2 x 106/mL dans un milieu à base d’azote de levure (YNB) et ajoutez 500 μL de suspension conidiale à 4,5 mL de milieu YNB dans un erlenmeyer autoclavé de 50 ml. Couvrir et placer le ballon dans un incubateur agitateur (200 tr/min à 37 °C) pendant 6 h.
- Transférez le milieu dans un tube de 15 ml. Centrifuger à 805 x g pendant 10 min à température ambiante et laver une fois dans du PBS. Centrifuger à nouveau et remettre en suspension la pastille dans un milieu indépendant de 1 mL de CO2, ce qui donne 3,6 x 106 conidies/mL.
REMARQUE : Les conidies s’agglutinent fréquemment après avoir gonflé, ce qui rend difficile un comptage précis, il est conseillé de calculer avec le nombre compté de conidies au repos utilisées.
3. Isolement des neutrophiles et des monocytes humains
- Prélever 20 ml de sang veineux de volontaires sains dans deux tubes sanguins de 10 ml contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Pour chaque donneur séparément, versez 20 ml de sang dans un tube de 50 ml et diluez avec 15 ml de PBS.
- Sous-couche dans le sang avec 15 ml d’une solution d’isolement des lymphocytes (densité 1,077 g/ml) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de fer. Placez l’aiguille au fond du tube et forcez doucement la solution d’isolement des lymphocytes à l’extérieur. Centrifugeuse à 630 x g pendant 20 min sans frein et à faible accélération.
- Préparez le PBS, réfrigéré sur de la glace.
note: Les étapes 3.4 et 3.5 doivent être suivies simultanément pour générer des monocytes (3.4) et des neutrophiles (3.5).
- À l’aide d’une pastette, prélevez la couche de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Il s’agit de la couche au centre entre le sérum jaune (supérieur) et la couche transparente de solution d’isolement des lymphocytes (inférieure), et transférée dans un tube frais de 50 ml.
- Remplissez le tube avec le PBMC jusqu’à 50 mL avec du PBS froid et centrifugez à 582 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et lavez-le deux fois avec du PBS froid et mettez-le en suspension dans 1 mL de PBS pour 20 mL de sang de donneur utilisé initialement.
- Faites des dilutions de 1:10 pour le comptage en ajoutant 20 μL de suspension cellulaire à 160 μL de PBS et 20 μL de bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Préparez une solution tampon en ajoutant 26 ml de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (SCF) et 2,1 ml de 0,5 M EDTA à 500 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Centrifuger les cellules pendant 10 min à 515 x g et les remettre en suspension dans 40 μL de solution tampon pour 1 x 107 cellules.
- Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajoutez 10 μL de microbilles CD14 par 1 x 107 cellules, mélangez bien et incubez pendant 15 min à 4 °C, en veillant à mélanger les tubes toutes les 5 min.
- Laver les cellules en ajoutant 1 mL de solution tampon par 1 x 107 cellules et centrifuger à 515 x g pendant 10 min.
- Aspirer complètement le surnageant et remettre en suspension jusqu’à 1 x 108 cellules dans 500 μL de solution tampon.
- Placer 1 colonne par échantillon sur un séparateur magnétique selon les instructions du fabricant. Tout d’abord, lavez une fois la colonne avec 500 μL de solution tampon
.
- Pipetez les 500 μL de suspension cellulaire à travers la colonne, attendez que la colonne sèche, puis lavez en répétant cette opération trois fois avec une solution tampon.
- Placez un nouveau tube de 15 ml sous la colonne et retirez la colonne du séparateur magnétique. Ensuite, rincez les cellules de la colonne dans le tube avec 1 mL de solution tampon
.
- Ajouter 4 mL de solution tampon et centrifuger à 515 x g pendant 10 min, puis remettre en suspension dans 1 mL de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Faites des dilutions de 1:10 pour le comptage en ajoutant 20 μL de suspension cellulaire à 160 μL de PBS et 20 μL de bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ajuster la concentration cellulaire à 6 x 105/mL avec RPMI et semer 200 μL sur une parabole d’imagerie à base de verre de 35 mm. Incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Le lendemain, avant l’imagerie, retirez le RPMI et ajoutez 200 μL de milieu indépendant du CO2.
note: Ces monocytes peuvent également être différenciés en divers sous-ensembles de macrophages avant l’imagerie. S’il s’agit d’une technique à explorer, un excellent point de départ est un article récent d’Ohradanova-Repic et al.
- Après avoir récolté la couche de PBMC, retirez tout le sérum et la majeure partie de la solution d’isolement des lymphocytes, mais veillez à ne pas retirer la petite bande blanche au-dessus de la pastille rouge car elle contiendra la plupart des neutrophiles.
- Préparez un stock tampon de lyse hypotonique 10x en ajoutant 83 g de chlorure d’ammonium (NH4Cl) et 10 g de bicarbonate de potassium (KHCO3) dans 1 L d’eau stérile. Conserver à 4 °C.
- Diluez ce bouillon 10x avec de l’eau stérile et ajoutez-le dans les tubes. Ensuite, retournez soigneusement 3 fois et incubez dans de la glace pendant 15 min.
- Centrifuger à 394 x g pendant 10 min et remettre en suspension dans un tampon de lyse hypotonique pendant 10 min dans de la glace.
- Centrifuger à 394 x g et laver deux fois avec du PBS froid. Remettre en suspension dans 1 mL de milieu indépendant du CO2 par donneur.
- Faites des dilutions de 1:10 pour le comptage en ajoutant 20 μL de suspension cellulaire à 160 μL de PBS et 20 μL de bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Pour la microscopie, ajoutez 200 μL de la même suspension cellulaire dans une boîte d’imagerie à base de verre de 35 mm.
REMARQUE : L’imagerie des neutrophiles ou la cytométrie en flux doivent être initiées immédiatement en raison de leur propension à subir l’apoptose si elles ne sont pas stimulées. Si cela n’est pas possible, les neutrophiles doivent être conservés sur de la glace et utilisés dès que possible (dans la même journée).
4. Microscopie vidéo sur cellule vivante
REMARQUE : Le choix du microscope dépendra de ce qui est disponible localement, mais la configuration du microscope devra inclure une platine inversée, une chambre environnementale chauffée à 37 °C et des filtres d’excitation/émission appropriés pour dsRed (532/561 nm) et AF633 (633 nm). Les conidies FLARE ne fonctionnent pas avec le laser 488 nm au lieu du laser 532/561 nm pour dsRed. Lorsque vous effectuez cette expérience pour la première fois, utilisez les conidies de contrôle sans couleur et monocolore pour tester la fluorescence de fond et le saignement entre les canaux dsRed et AF633.
- Allumez le chauffage du microscope avant l’expérience et laissez suffisamment de temps à la chambre de contrôle de l’environnement pour se réchauffer à 37 °C. Le temps nécessaire pour que la température de la chambre se stabilise varie selon les configurations de microscope.
- Allumez le microscope et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie. Montez la parabole d’imagerie sur la platine du microscope et ajustez la mise au point pour trouver les neutrophiles ou les monocytes humains.
- Pour le dsRed et l’AF633, réglez la puissance du laser sur 10 % et le temps d’exposition sur 1 s dans les paramètres d’acquisition.
- Retirer la lame d’imagerie et ajouter 100 μL de suspension conidique FLARE 3 x 106/mL dans les puits appropriés (volume total 300 μL/puits). Notez le temps pendant lequel les conidies FLARE sont ajoutées à la parabole.
- Remettez la diapositive sur la scène et ajustez la sensibilité de l’appareil photo pour dsRed et AF633 afin de voir clairement les conidies sans surexposer l’image. Configurez une liste de points d’étape si l’acquisition de plusieurs points est requise.
- Commencez l’imagerie lorsque tous les points sont nets, que les canaux sont optimisés et que le temps et la durée du cycle sont réglés. Le temps de cycle et la durée de l’imagerie dépendent de la question expérimentale. L’objectif est de maintenir le temps de cycle aussi court que possible (≤2 min) avec 1 min permettant une analyse approfondie de la dynamique d’absorption.
