Utilisation de bicouches lipidiques soutenues par des billes pour étudier la sortie synaptique des lymphocytes T

Résumé

Source : Céspedes, P. F., et al. Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des billes pour étudier la production particulaire des synapses immunitaires des lymphocytes T. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo illustre la reconstitution des cellules présentatrices d’antigènes synthétiques à travers les bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur application dans l’évaluation de la sortie synaptique générée par les cellules T activées.

Protocole

1. Étalonnage de la densité protéique sur les BSLB (bicouches lipidiques supportées par des billes)

1. Avant de prélever les billes de silice non fonctionnalisées de 5,00 ±0,05 μm de diamètre, bien mélanger la solution mère et remettre en suspension les gros amas de billes sédimentés au fond des flacons.
   REMARQUE : Les billes de silice ont tendance à sédimenter rapidement, ce qui peut entraîner des erreurs de comptage. Mélangez vigoureusement en pipetant de haut en bas de la moitié du volume maximal d’une micropipette P1000.
2. Diluez 1 μL de solution de billes dans 1 000 μL de PBS, comptez les billes à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre et calculez leur concentration par mL.
   note: La coloration au bleu de trypan n’est pas nécessaire pour visualiser les billes de silice.
3. Calculer le volume de billes de silice nécessaire pour 5 × 10⁵ BSLB finaux par point du titrage.
4. Transférez le volume requis de billes de silice dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml.
5. Lavez les billes de silice trois fois avec 1 mL de PBS stérile et centrifugez-les pendant 15 s sur une microcentrifugeuse de paillasse à RT (à régime fixe).
   REMARQUE : Lors du retrait de la solution de lavage, évitez de déranger la bille de bille. Une petite colonne tampon n’affectera pas l’étalement des liposomes composant le mélange maître de liposomes, car ceux-ci sont également dans le PBS.
6. Préparez trois volumes du mélange maître de liposomes pour assembler le BSLB sur les billes de silice lavées (p. ex., si le volume total initial de billes de silice est de 20 μL, préparez un minimum de 60 μL du mélange maître de liposomes).
7. Pour les titrages en % molaire de Biotinyl Cap PE
   1. Préparez les mélanges maîtres lipidiques contenant des dilutions 5 fois plus de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluer le 0,4 mM de Biotinyl Cap PE mol % dans une matrice 100 % DOPC.
      2. Mélanger chaque point de titrage du Biotinyl Cap PE à un rapport de 1:1 (vol :vol) avec une solution de 0,4 mM 25 % DGS-NTA(Ni) de sorte qu’un dernier 12,5 % molaire de lipides contenant du Ni soit présent dans tous les titrages.
         note: Les 12,5 % molaires (vol :vol %) de lipides contenant du Ni représentent la composition lipidique mixte des BSLB sur lesquels les protéines marquées par His peuvent également être testées dans des étalonnages parallèles. Par exemple, étant donné que tous les stocks de liposomes sont préparés à la même concentration molaire, pour atteindre le pourcentage molaire cible de mélange dans 200 μL de mélange final de liposomes, il suffit de mélanger 100 μL de 25 % molaire de DGS-NTA contenant du nickel avec 100 μL de 100 % molaire DOPC.
   2. Transférez 5 × 10⁵ billes de silice lavées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, de sorte qu’un point de titrage du pourcentage molaire de Biotinyl Cap PE soit assemblé par tube.
   3. Ajoutez les mélanges maîtres de titrage en mol % de Biotinyl Cap PE aux billes de silice lavées et mélangez doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume total. Évitez de former des bulles, qui détruisent en excès la bicouche lipidique.
   4. Ajoutez de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BLB maintenant en formation pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
   5. Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 mM avant le stockage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
      note: Connectez un petit tube à la bouteille de gaz argon/azote. Avant d’ajouter du gaz dans les tubes, ajustez le régulateur de la bouteille de gaz de manière à ce que la pression ne dépasse pas 2 psi. Connectez une pointe de pipette stérile à la tubulure de sortie pour diriger le flux de gaz à l’intérieur du stock de liposomes pendant 5 secondes et fermez rapidement le couvercle. Dans le cas de stocks lipidiques, fermez le couvercle du tube avec un film de paraffine avant de le stocker à 4 °C.
   6. Déplacez les BSLB vers un mélangeur de laboratoire vertical à angle variable (voir le tableau des matériaux) et mélangez pendant 30 min à RT en utilisant un mélange orbital de 10 tr/min.
      note: Cette étape permettra d’éviter la sédimentation des billes lors de la formation de la bicouche lipidique supportée.
   7. Faites tourner les billes en centrifugeant pendant 15 secondes à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez-les trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
   8. Bloquez les BSLB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % ou de BSA à 5 % contenant 100 μM de NiSO₄ pour saturer les sites NTA et 200 nM de streptavidine pour enrober uniformément tous les sites d’ancrage de la biotine sur les BSLB. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas de la moitié du volume total et incubez dans le mélangeur vertical pendant 20 min maximum à RT et 10 tr/min.
   9. Faites tourner les BSLB en les centrifugeant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez-les trois fois avec 1 mL de tampon HBS/HSA (BSA).
      note: Gardez les billes lavées verticalement avec un petit volume de tampon de lavage couvrant les BSLB. Évitez la déshydratation des BSLB car l’air détruira la bicouche lipidique.
8. Pour le titrage de protéines marquées His-té sur 12,5 % molal de BSLB contenant du DGS-(Ni) NTA
   1. Préparez trois volumes de mélange maître de liposomes contenant 12,5 % molaires finaux de DGS-NTA(Ni).
   2. Utilisez le mélange principal de liposomes pour remettre en suspension les billes de silice lavées et mélangez doucement en pipetant de haut en bas sur la moitié du volume total. Évitez de former des bulles, qui en excès endommagent la bicouche lipidique.
   3. Ajoutez de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BLB maintenant en formation pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
   4. Ajouter de l’argon aux stocks de lipides de 0,4 mM avant l’entreposage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
   5. Déplacez les BSLB vers le mélangeur vertical et mélangez pendant 30 min à RT en utilisant un mélange orbital à 10 tr/min.
   6. Faites tourner les billes en centrifugeant pendant 15 secondes à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez-les trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
   7. Bloquez les BSLB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % (ou 5 % de BSA) contenant 100 μM de NiSO4 pour saturer les sites NTA sur les BSLB. Mélangez doucement et incubez dans le mélangeur vertical pendant pas plus de 20 min à RT et 10 tr/min.
   8. Lavez trois fois avec HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de solution de blocage.
   9. Dans une nouvelle plaque à 96 puits à fond en U, préparez des dilutions en série de 2 fois des protéines.
      1. Préparer une concentration initiale de 100 nM pour la protéine d’intérêt dans un volume total de 200 μL de tampon HBS/HSA (BSA), répartir 100 μL de cette solution dans la première colonne, et les 100 μL restants sur le dessus de la colonne #2 contenant 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
      2. Continuez en transférant en série 100 μL de la colonne #2 à la colonne #3 et répétez l’opération au besoin pour couvrir tous les points de titrage. Laissez la dernière colonne de la série sans protéine, car elle sera utilisée comme référence vierge pour la quantification.
   10. Remettre en suspension les BSLB préparés dans un volume tel que 5 × 10⁵ BSLB soient contenus dans 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
   11. Transférer 100 μL de la suspension BSLB dans les puits d’une deuxième plaque à fond en U de 96 puits, de sorte que chaque puits reçoive 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Faites tourner la deuxième plaque contenant des flaques de plomb pendant 2 minutes à 300 × g et RT et jetez le surnageant.
   13. Transférez les volumes de 100 μL de la plaque de titrage des protéines vers la plaque contenant les BSLB sédimentés. Mélangez doucement, évitez la génération excessive de bulles pendant le pipetage et incubez pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protéger de la lumière avec du papier d’aluminium.
   14. Laver la plaque trois fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à RT.
   15. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage est directement conjuguée aux fluorochromes et a des valeurs F/P connues.
   16. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage n’est pas marquée ou conjuguée à des fluorochromes ou si aucun étalon de bille MESF n’est disponible, utilisez des anticorps conjugués Alexa Fluor 488 ou 647 avec des valeurs F/P connues pour colorer le BSLB enrobé de protéines.
   17. Coloration avec des concentrations saturantes d’anticorps de quantification.
       REMARQUE : Selon le niveau d’expression cible, ceux-ci varient entre 5 et 10 μg/mL.
   18. Colorer pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur de plaques. Protégez-le de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.
   19. Laver deux fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) et une fois avec du PBS en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à RT.
       note: Utilisez du PBS, pH 7,4 pour remettre en suspension les BSLB lavés avant l’acquisition. N’utilisez pas de tampons contenant des protéines, car cela entraînerait la formation de bulles lors du mélange automatique des échantillons avec des échantillonneurs à haut débit.
   20. Acquérez les normes MESF, en vous assurant que les pics les plus brillants restent dans la plage de détection linéaire du détecteur de quantification (canal), comme illustré à la figure 1B (vii).
   21. Acquérez les échantillons manuellement ou à l’aide de HTS. Si vous utilisez ce dernier, remettre en suspension les BSLB dans 100 μL de PBS et obtenir 80 μL en utilisant un débit compris entre 2,5 et 3,0 μL/s, un volume de mélange de 100 μL (ou 50 % du volume total si le volume de remise en suspension est inférieur), une vitesse de mélange de 150 μL/s et cinq mélanges pour garantir que les BSLB sont monodispersés.
   22. Exportez les fichiers FCS.
   23. Concentrez-vous sur des événements uniques pour les analyses (Figure 2A), car les doublets ou les triplets introduiront des erreurs dans la détermination. Utilisez l’identification imbriquée des événements uniques, comme indiqué à l’étape 1.2.3 du protocole.
   24. Mesurez l’IMF de chaque fraction MESF (1-4) et soustrayez l’IMF des billes vierges pour extraire les IMF corrigées (cMFI).
   25. Effectuez une analyse de régression linéaire pour extraire la pente (b) de MESF sur le cMFI calculée pour les normes MESF.
   26. Extraire l’IMF de chaque point de titrage et soustraire l’IMF des billes sans protéines pour obtenir des ICMc.
   27. Divisez les cMFI par la pente calculée pour extraire la MESF liée aux BSLB pour chaque point de titrage.
   28. Divisez la MESF liée aux BSLB par la valeur F/P de l’anticorps de quantification pour extraire le nombre moyen de molécules liées par BSLB.
   29. À l’aide du diamètre des BLB (5,00 ± 0,05 μm), extraire la surface des billes (SA = 4pr2) pour calculer les densités finales de protéines (molec./μm²) par point de titrage (concentration en protéines).
   30. Effectuez une nouvelle analyse de régression de la concentration en protéines par rapport à la densité protéique pour calculer la pente (b) de la droite de meilleur ajustement.
       note: La concentration de 12,5 % molaire de DGS-NTA(Ni) confère une capacité d’ancrage maximale d’environ 10 000 molec./μm2 10 sans induire l’activation non spécifique des lymphocytes T ni affecter la mobilité latérale des SLB.

2. Réalisation d’expériences de transfert synaptique entre les lymphocytes T et les BLB

1. Avant d’exécuter l’expérience de transfert synaptique
   1. Acquérez des BSLB non fluorescents, des BSLB avec des lipides fluorescents, des cellules non colorées (ou billes de compensation ; voir le tableau des matériaux) et des cellules colorées unicolores (ou billes de compensation) pour identifier les interactions du spectre de fluorescence de l'instrument. Concentrez-vous sur les détecteurs à fort débordement pour redessiner le panneau polychromatique, augmenter la sensibilité et réduire l’erreur de mesure sur les détecteurs critiques.
   2. Titrez les anticorps de détection pour trouver la concentration optimale, ce qui permet de détecter les événements positifs sans compromettre la détection des effets négatifs.
      note: Répétez cette étape chaque fois qu’il y a un changement de lot d’anticorps, car les valeurs F/P et la luminosité varient d’un lot à l’autre.
   3. Facultatif : Optimisez les tensions PMT en acquérant l’échantillon à différentes plages de tension (c’est-à-dire une marche de tension) pour trouver les PMT conduisant à un signal optimal sur le bruit (c’est-à-dire la séparation des négatifs et des positifs tout en veillant à ce que le signal de la population la plus brillante reste dans la plage linéaire).
2. Mesure du transfert de sortie des lymphocytes T vers les BSLB
   1. Préparez du RPMI 1640 supplémenté (ci-après milieu R10) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 10 mM d’HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Utilisez le milieu R10 pour cultiver et développer les lymphocytes T.
   2. Le jour 1, isolez les lymphocytes T du sang périphérique ou des chambres du système de leucoréduction (LRS). Utilisez des trousses d’isolement et de séparation de cellules d’immunodensité (voir le tableau des matières) pour l’enrichissement des lymphocytes T CD4+ et CD8+ humains.
   3. Ensemencer les cellules à une concentration finale variant entre 1,5 et 2,0 × 10⁶ cellules/mL, à l’aide de plaques à 6 puits avec un maximum de 5 mL au total par puits.
   4. Activez les lymphocytes T à l’aide d’un rapport de 1:1 de billes magnétiques d’activation des lymphocytes T humains (anti-CD3/anti-CD28) (voir le tableau des matériaux) et ajoutez 100 UI d’IL-2 humaine recombinante pour favoriser la prolifération cellulaire et la survie.
   5. Le jour 3, retirez les billes magnétiques activatrices à l’aide de colonnes magnétiques (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que les billes magnétiques restent fixées sur les côtés du tube avant de récupérer les cellules pour des étapes de lavage supplémentaires.
   6. Lavez à nouveau les billes magnétiques avec 5 ml de milieu R10 frais, mélangez bien et remettez-les dans l’aimant. Récupérez ce volume et mélangez-le avec les cellules récupérées à l’étape 1.2.5.
   7. Remettre les cellules en suspension à 1,5-2 × 10⁶ cellules/mL dans du R10 frais contenant 100 U/mL d’IL-2. Réapprovisionner le milieu après 48 h, en s’assurant que le dernier ajout d’IL-2 soit 48 h avant le jour de l’expérimentation (jours 7 à 14 de culture).
   8. Le jour de l’expérience de transfert synaptique, préparer le milieu de test de transfert synaptique en complétant le milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol avec 10 % de FBS, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Ne pas inclure l’IL-2 humaine recombinante.
   9. Compter les cellules à l’aide d’une coloration au bleu de trypan ou d’une exclusion du courant électrique et les remettre en suspension jusqu’à une concentration finale de 2,5 × 10⁶ cellules/mL dans le milieu. Si une mort cellulaire excessive est observée (>10 %), éliminez les cellules mortes/mourantes à l’aide d’un mélange de polysaccharide et de diatrizoate de sodium (voir le tableau des matières) comme suit :
      1. Déposer 15 mL de culture cellulaire sur 13 mL de solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      2. Centrifugeuse pour 1 250 × g pendant 20 min à RT avec accélération et désaccélération minimales. Prélever la couche cellulaire (nuage) à l’interface entre le milieu et la solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      3. Lavez les cellules au moins deux fois avec un milieu de dosage de transfert synaptique préchauffé (préparé à l’étape 1.2.7).
      4. Compter et remettre en suspension les cellules jusqu’à une concentration finale de 2,5 × 10⁶/mL à l’aide d’un milieu de dosage de transfert synaptique. Coculture de 100 μL de cette suspension cellulaire avec des BLR (voir étape 1.2.15).
   10. Calculez le nombre de BSLB nécessaires pour l’expérience ; considérez tous les différents mélanges maîtres de protéines et titrages d’antigènes à tester (soit des monomères peptidiques HLA/CMH biotinylés, soit des Fab anti-CD3ε monobiotinylés).
   11. Assemblez les BSLB en suivant les mêmes étapes que celles de la section 5 du protocole mais cette fois-ci, combinez tous les titrages de protéines et de lipides nécessaires à la reconstitution d’une membrane APC complexe (Figure 3A). Conservez les mêmes relations vol/vol entre le volume initial des billes de silice et le volume du mélange de protéines utilisé lors des étalonnages, ainsi que les temps et les températures utilisés pour le chargement des BSLB. Par exemple, si 0,5 μL de billes de silice/puits et 100 μL/puits de mélange de protéines ont été utilisés pour l’étalonnage initial, maintenez des rapports vol :vol de 5:1 000 pour préparer les BSLB à co-cultiver avec les lymphocytes T.
   12. Une fois que les BSLB ont été chargés avec le mélange de protéines d’intérêt, lavez-les deux fois avec HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de protéines non liées. Utilisez des vitesses de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à RT à chaque étape de lavage et jetez les surnageants.
   13. Remettre en suspension les 5 × 105 BSLB par puits dans 200 μL.
   14. Transférez 100 μL par puits sur une nouvelle plaque à fond en U de 96 puits pour faire une copie, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 2,5 × 10⁵.
   15. Faites tourner les BSLB à 300 × g pendant 2 minutes et RT et jetez le surnageant.
   16. Remettre les billes en suspension à l’aide de 100 μL de suspension de lymphocytes T ; mélanger doucement pour éviter la formation de bulles.
   17. Incuber les cocultures pendant 90 min à 37 °C.
       note: Alternativement, les cellules et les billes peuvent être remises en suspension dans un tampon HBS/HSA (BSA) au lieu d’un RPMI sans rouge de phénol pour la coculture. Dans ce cas, l’incubation doit être réalisée dans un incubateur sans CO₂ car ce gaz va rapidement acidifier le tampon en l’absence de bicarbonate.
   18. Refroidissez les cocultures de cellules BSLB-T en les incubant d’abord à la RT pendant au moins 15 min. Protégez-les de la lumière.
   19. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 × g et RT ; jeter le surnageant.
   20. Remettre en suspension les cellules dans du RT 2 % BSA-PBS (sans Ca₂⁺ et Mg₂⁺) pour le blocage. Placez les cellules sur de la glace pendant 45 min. Protéger de la lumière.
   21. Pendant l’incubation des cellules, préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant de la BSA à 2 % filtrée à 0,22 μm dans du PBS comme tampon de coloration, ce qui fournira un blocage supplémentaire.
       note: Certains lots d’anticorps conjugués à des colorants Brilliant Violet ont tendance à se lier aux BSLB de manière non spécifique. Le blocage avec 5 % de BSA-PBS permet de réduire ce bruit. À partir de maintenant, assurez-vous de maintenir la chaîne du froid intacte.
   22. Faites tourner les cocultures à 500 × g pendant 5 min et 4 °C. Avant de jeter les surnageants, assurez-vous brièvement que la pastille est présente en inspectant le fond de la plaque à 96 puits à l’aide d’un rétroéclairage.
   23. À l’aide d’une pipette multicanaux, remettre en suspension les cellules dans le mélange maître de coloration contenant des concentrations d’anticorps optimisées.
       note: Utilisez des pointes de pipette sans filtre pour éviter la génération de bulles et d’erreurs dans la distribution des volumes de coloration.
   24. Comprend les cellules et les BSLB marqués par isotype, les BSLB fluorescents et non fluorescents, et les cellules et les BSLB colorés seuls. Respecter le nombre total d’événements par puits pour tous les témoins (c.-à-d. seulement les BLP contenant 5 × 10⁵ BLB/puits, et seulement les témoins cellulaires contenant 5 × 10⁵ cellules/puits pour éviter une augmentation relative des anticorps par événement coloré).
   25. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas sur la moitié du volume et incubez pendant 30 min sur de la glace. Protéger de la lumière.
   26. Lavez les cellules et les BSLB deux fois avec du BSA-PBS à 2 %, pH 7,4 et des étapes de sédimentation de 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les cocultures lavées dans 100 μL de PBS et les acquérir immédiatement.
   27. Si une fixation est nécessaire, fixer en utilisant 0,5 % p/v de PFA dans du PBS pendant 10 min, laver une fois et conserver dans du PBS jusqu’à l’acquisition. Protéger de la lumière.
   28. Avant la compensation, acquérez les normes MESF, en vous assurant que les populations les plus faibles et les plus brillantes se situent dans la plage de mesure linéaire.
   29. Acquérez des échantillons de compensation, calculez la compensation et appliquez la matrice de compensation (lien) à l’expérience.
   30. Acquérir et sauvegarder un minimum de 2 × 10⁴ étalons MESF au total pour chacun des canaux de quantification.
   31. Pour l’acquisition à l’aide d’échantillonneurs à haut débit, régler l’acquisition de l’instrument sur la norme, régler l’acquisition de l’échantillon à 80 μL (ou 80 % du volume total), débit d’échantillon entre 2,0 et 3,0 μL/s, volume de mélange de l’échantillon de 50 μL (ou 50 % du volume total pour éviter la formation de bulles pendant le mélange), mélange de l’échantillon de 150 μL/s, et mélange par puits entre 3 et 5.
   32. Acquérir un minimum de 1 × 10⁴ BSLB simples par échantillon (voir les panneaux (i) à (vi) de la figure 3B pour la stratégie de contrôle de référence).
   33. Lavez le cytomètre en fonctionnement pendant 5 minutes, une solution de nettoyage suivie de 5 minutes d’eau ultrapure avant d’éteindre l’instrument. Si vous utilisez le HTS, suivez les options sous l’onglet HTS et l’option Nettoyer.
   34. Exporter les fichiers FCS.

3. Mesure du transfert synaptique des particules vers les BSLB

1. Ouvrez les fichiers FCS de l’expérience. Sélectionnez la population de cellules et de BLR en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérale et directe (SSC-A ou FSC-A), comme le montre la figure 3B (i).
2. Sélectionnez les événements dans la fenêtre d’acquisition continue (Figure 3B (ii)).
3. Se concentrer sur les événements uniques des deux cellules et du BSLB ; identifier d’abord les cellules uniques en fonction du faible W dans les portes séquentielles FSC-W/FSC-H (singlets-1, Figure 3B panel (iii)) et SSC-W/SSC-H (singlets-2 ; Figure 3B (iv)). Définissez une porte singulets-3 supplémentaire en sélectionnant des événements avec FSC-A et FSC-H proportionnels (Figure 3B, panneau (v)).
4. Extraire l’IFM des fractions MESF à blanc et 1 à 4 et des cellules simples et MESF pour chaque échantillon d’expérience.
5. Générez des valeurs MFI corrigées (cMFI) pour les fractions MESF 1 à 4 en soustrayant la MFI de la population de billes vierges de chaque fraction.
6. Générez des cMFI pour des BSLB et des cellules simples (reportez-vous au panneau Figure 3C (i)).
7. Utilisez le signal de BSLB coloré avec des anticorps de contrôle d’isotype pour corriger l’IMF de BSLB coloré avec des anticorps contre les marqueurs de cellules T pertinents. Utilisez cMFI pour calculer le pourcentage de transfert synaptique normalisé (NST %) à l’aide de l’équation illustrée dans le panneau 3C de la figure 3C (ii).
8. Si vous vous intéressez plutôt aux particules spécifiquement transférées en réponse au déclenchement du TCR, soustrayez le signal des BSLB nulles de l’IMF des BSLB agonistiques. Utilisez ce cMFI pour calculer le pourcentage NST induit par le TCR à l’aide de l’équation illustrée dans le panneau 3C de la figure 3C (ii).
9. Si vous souhaitez déterminer le nombre total de molécules transférées sous forme de cargaison de particules à travers l’interface Lymphocy-Lymphocy-BSLB, acquérez des billes de référence MESF en utilisant les mêmes paramètres d’instrument et la même session d’acquisition pour les cocultures Lymphocytes T-BSLB.
10. Analysez les populations de billes MESF et extrayez leurs cMFI. Calculez la pente de la droite de meilleur ajustement pour l’analyse de régression de MESF sur cMFI.
11. Utilisez la pente calculée pour extraire le nombre de MESF déposés sur les BSLB. Utilisez des cMFI calculés à l’aide de contrôles d’isotypes ou de BSLB nulls comme blancs pour extraire le nombre de MESF transférés spécifiquement aux BSLB stimulants.
12. Calculez le nombre de molécules de marqueurs transférées aux LBE en divisant les MESF calculés (moyens) par LBE par la valeur F/P de l’anticorps de quantification.

Résultats

Figure 1 : Quantification absolue des protéines à la surface des APC. (A) Exemple de mesures quantitatives par cytométrie en flux de l’ICAM-1 à la surface des lymphocytes B amygdaliens (Foll. Bc) et les lymphocytes T auxiliaires (TFH). (i-vii) Stratégie de contrôle pour l’analyse d’un seul CXCR5+ Bc et TFH isolés à partir d’amygdales palatines humaines. La str...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture cellulaire à 96 puits avec couvercle, traitée par culture tissulaire, apyrogène	Costar®	Référence 3799	Pour la coloration FCM et la co-culture de BSLB et de cellules.
Plaque de culture cellulaire à 96 puits à fond en V avec couvercle, traitée par culture tissulaire, apyrogène.	Costar®	Référence 3894	Pour la coloration FCM de cellules ou de billes en suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (ester de succinimidyle)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester de succinimidyle)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 et A20006
Multiwell 6 puits Culture tissulaire traitée au plasma de gaz sous vide	Faucon	353046	Pour la culture et l’expansion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ purifiés.
Caséine de lait bovin, adaptée comme substrat pour la protéine kinase (après déphosphorylation), poudre purifiée
Dynabeads Activateur Humain CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	Référence 12321D	Pour l’élimination de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 dans des volumes inférieurs à 2 mL
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Pour l’élimination de Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 dans des volumes inférieurs à 15 mL
Sérum fœtal bovin qualifié, un sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Nécessite une inactivation thermique pendant 30 min à 56 oC
CD154 anti-humain (CD40L), clone 24-31	BioLégende	310815 et 310818	Conjugués Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, respectivement
Hamster Arménien IgG Alexa Fluor 647 Contrôle isotype, clone HTK888	BioLégende	400902	Etiqueté maison avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester succinimidylique)
Configuration et suivi des billes du cytomètre BD	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Suivi de la performance des instruments avant FCM quantitatif