La méthode suivante est adaptée pour tester des souches concurrentes avec des souches productrices d’inhibiteurs.
REMARQUE : Ce protocole implique la génération d’aérosols avec des cultures bactériennes. Cela ne peut être effectué que dans un espace confiné avec la mise en œuvre de considérations de sécurité approuvées localement. La pulvérisation de la culture sur les plaques de gélose à l’intérieur d’une enceinte de sécurité de niveau 2 réduira au minimum la contamination des plaques de gélose et de l’environnement environnant. Cela protégera également le chercheur contre l’inhalation par aérosol des bactéries pulvérisées, ce qui est une préoccupation majeure si le chercheur utilise des organismes de niveau de confinement 2. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté. Il est préférable de couvrir la zone entourant la boîte de Pétri avec un tissu absorbant jetable. Il est conseillé de décontaminer après la pulvérisation à l’aide d’une lumière UV.
1. Préparation des plaques de gélose
- Préparez la gélose pour perfusion cerveau-cœur (BHI) conformément aux instructions du fabricant.
- Autoclave la gélose BHI à 121 °C, 15 livres-force par pouce carré (psi) pendant 20 min, ou selon les recommandations du fabricant de l'autoclave, pour stériliser.
- Versez 15 ml d’aliquotes de gélose BHI stérilisée dans des boîtes de Pétri stériles et laissez-la prendre.
note: S’assurer que chaque plaque de gélose à utiliser dans le test provient du même stock de gélose et qu’il y a la même quantité de gélose dans chaque plaque. Cela limite la variabilité des nutriments disponibles et la diffusion des inhibiteurs entre les plaques, ce qui permet la comparabilité.
2. Préparation du bouillon stérile
- Préparez le bouillon BHI conformément aux instructions du fabricant.
- Ajouter 10 ml d’aliquotes de BHI dans des flacons universels en verre de 28 ml.
- Autoclave le bouillon BHI à 121 °C, 15 psi pendant 20 min, ou selon les recommandations du fabricant de l'autoclave, pour stériliser.
note: Assurez-vous que tout le bouillon utilisé dans l’essai provient du même lot de bouillon autoclavé en même temps afin de limiter les variations de nutriments qui pourraient entraîner des variations dans les résultats.
3. Préparation des bouteilles de vaporisateur stériles
- Démontez la bouteille du vaporisateur.
- Vaporisez 5 % d’agent de nettoyage tensioactif à travers le vaporisateur pour éliminer les contaminants internes, et trempez la bouteille du vaporisateur, le couvercle et le vaporisateur dans l’agent nettoyant tensioactif à 5 % pendant la nuit.
note: Des gants et un équipement de protection individuelle approprié doivent être utilisés lors de la manipulation des produits de nettoyage de surface.
- Faites sécher le vaporisateur, le couvercle et les bouteilles sous une hotte à flux d’air stérile.
- Remplissez la bouteille avec de l’éthanol à 70 %, rattachez le vaporisateur et vaporisez un peu d’éthanol à travers le vaporisateur.
- Mettez le couvercle sur le vaporisateur et stockez l’éthanol à l’intérieur jusqu’à utilisation.
- Immédiatement avant l’utilisation, rincez aseptiquement la bouteille avec du bouillon BHI stérile et vaporisez le bouillon à travers le vaporisateur.
note: Cela empêche l’éthanol d’affecter l’inoculum ajouté à la bouteille à la section 6.3.
4. Préparation de la ou des cultures bactériennes pendant la nuit
- Étaler les souches compétitrices et inhibitrices sur une plaque de gélose BHI stérile et incuber à 37 °C en aérobie pendant environ 18 heures (toute la nuit).
note: Cette plaque produit un stock de bactéries qui peut être utilisé pour plusieurs réplicats au cours de la même semaine lorsqu’elle est stockée à 4 °C.
- Inoculer 10 ml de bouillon BHI stérile avec une seule colonie de la souche bactérienne concurrente requise dans un flacon universel de 28 ml.
- Incuber la bouteille universelle à 37 °C en aérobie pendant la nuit en l’agitant à 250 tr/min dans un agitateur orbital.
5. Culture ponctuelle de l’isolat producteur d’inhibiteurs
- Préparez la ou les cultures pendant la nuit comme décrit à la section 4.
- Avant l’inoculation, assurez-vous que les plaques de gélose sont complètement sèches, sans condensation sur le couvercle, (par exemple en incubant la plaque pendant 60 minutes à 37 °C), ce qui empêche l’inoculum de se propager sur la plaque à partir du site d’inoculation.
- Pipeter 25 μl de la culture de nuit au centre des plaques de gélose. Évitez d’enfoncer complètement le piston de la pipette pour éviter les bulles d’air qui pulvérisent la culture sur la gélose.
- Laissez sécher la culture à température ambiante pour limiter la propagation de la culture. Incuber les plaques de gélose à 37 °C en aérobie pendant la nuit.
6. Préparation de l’inoculum de pulvérisation de la ou des souches concurrentes d’essai
- Préparez la culture de nuit comme décrit dans la section 4. Diluer la culture de nuit 10 fois dans un bouillon BHI pour obtenir environ 4 x 106 unités formant colonies (UFC) ml-1 et une suspension de OD600 0,3 ±0.05.
note: Une dilution de 10 fois ne donnera pas 4 x 106 UFC ml-1 pour toutes les espèces bactériennes, calculer le facteur de dilution nécessaire en étalant des dilutions en série de placage entre 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Versez la culture diluée dans un flacon de vaporisateur de parfum en plastique stérile.
note: Le volume total doit être supérieur à ce qui est nécessaire pour le nombre de plaques de gélose pulvérisées. Environ 250 μl par plaque conviennent à une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre.
7. Essai d’inhibition de la croissance différée
- Vaporisez la culture à travers chacune des bouteilles du vaporisateur pour vous assurer que la culture est chargée dans le mécanisme de pulvérisation avant de pulvériser sur la gélose.
- À une distance d’environ 15 cm au-dessus de la gélose, vaporisez environ 250 μl de culture diluée (3 pulvérisations d’un vaporisateur typique de 50 ml) sur toute la surface de la gélose. Incuber les plaques de gélose à 37 °C en aérobie pendant la nuit. Répétez l’opération pour les autres assiettes avec le même nombre de pulvérisations.
8. Interprétation des résultats du test d’inhibition de croissance différée
- Mesurer la zone d’inhibition de la croissance de la souche concurrente pulvérisée (figure 1A-C, « X » à « X ») en millimètres, en soustrayant le diamètre de la tache centrale de l’inhibiteur-producteur (figure 1A-C, « Y » à « Y »).
REMARQUE : La figure 1E montre comment ces données pourraient être présentées
- Notez le score de clarté des zones d’inhibition.
note: Cela indique le degré d’inhibition observé. Des exemples sont présentés dans la figure 1A-D, les souches pouvant être utilisées pour la normalisation sont suggérées dans la section des résultats représentatifs. L'échelle suivante peut être utilisée pour l'évaluation de la clarté : un score de clarté de 0 pour décrire une zone d'inhibition complète de la croissance de la souche concurrente. Un score de 1 décrit une zone d’inhibition presque complète de la croissance, avec seulement des colonies individuelles présentes dans la zone de clairière. Un score de 2 décrit une zone visible de croissance réduite, la croissance à l’intérieur de cette zone est confluente ou presque confluente mais réduite en densité de >50 %. Un score de 3 ne décrit qu’une réduction minime de la croissance, une croissance confluente et réduite de moins de 50 %, et une zone est encore visible et mesurable. Un score de 4 ne décrit aucune inhibition visible de la croissance. Un score de 5 indique que la croissance de la souche concurrente a été augmentée à proximité de la souche productrice d’inhibiteurs d’essai. Voir la figure 1 pour des exemples. Ces scores sont subjectifs pour l’expérimentateur.
