Un test pour quantifier les salmonelles cytosoliques et vacuolaires dans les macrophages primaires infectés

Résumé

Source : Meunier, E., et al. Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente un test permettant de quantifier la présence cytosolique et vacuolaire de Salmonella typhimurium à l’intérieur de macrophages dérivés de la moelle osseuse à l’aide de la perméabilisation différentielle. Les macrophages sont infectés par une protéine fluorescente exprimant Salmonella, qui est internalisée à l’intérieur d’une structure vacuolaire spécialisée appelée vacuole contenant Salmonella ou SCV. Un sous-ensemble de bactéries s’échappe du VCS et pénètre dans le cytosol. La membrane plasmique riche en cholestérol des macrophages est perméabilisée à l’aide de la digitonine, laissant le SCV intact. Lors du marquage des bactéries cytosoliques avec un anticorps marqué par fluorescence, le pourcentage de bactéries vacuolaires et cytosoliques est quantifié à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Protocole

1. Dosage de la digutonine avec Salmonella exprimant mCherry (analyse basée sur FACS)

1. Préparation des bactéries
   Remarque : Le sl1344 de type sauvage de Salmonella (résistant à la streptomycine) exprimant mCherry à partir d’un plasmide (pFPV codant pour mCherry sous le promoteur rpsM) est utilisé dans cet essai. La phagocytose et la prolifération bactériennes n’ont pas été modifiées par l’expression constitutive de mCherry (données non présentées).
   1. Inoculer la souche 1 jour avant l’infection dans 3 ml de milieu LB complété par de la streptomycine (90 μg/ml) et de l’ampicilline (100 μg/ml, vecteur exprimant mCherry) dans un agitateur à 37 °C O/N.
2. Placage des cellules pour l’infection.
   1. Semez des BMDM de type sauvage dans une plaque de 24 puits à une densité de 1,25 x 10⁵ cellules/puits dans 1 ml de milieu macrophage primaire (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FCS, inactivé par la chaleur, 56 °C, 30 min), 1 % d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1 % de L-glutamine et 10 % de surnageant L929 (milieu conditionné à partir de cellules L929 productrices de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)). Selon le tableau 1, les puits de semences tiennent compte des conditions individuelles. Ajouter des lamelles de recouvrement aux puits utilisés comme témoins (tableau 1).
   2. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Préparation des bactéries à l’infection.
   1. Le lendemain, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture de nuit en diluant la culture à 1:10 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en mesurant la DO₆₀₀ par rapport à un témoin PBS uniquement. Cela garantit que l’OD₆₀₀ est mesuré dans la plage linéaire du spectrophotomètre.
   2. Calculez la concentration de Salmonella par ml. Une DO₆₀₀ de 1 correspond à 1 x 10⁹ bactéries.
   3. Diluez les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10⁶ cellules/ml.
4. Infection des cellules par Salmonella.
   1. Ajouter 1 ml de milieu de macrophage dans les puits témoins non infectés (B1-B3, C1-C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella dans les puits A1 à A5 pour atteindre une multiplicité d’infection (m.o.i.) de 10 bactéries par cellule.
   2. Centrifuger la plaque pendant 15 min à 300 x g à 37 °C pour synchroniser l’infection. Transvasez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
5. Tuer les salmonelles extracellulaires avec de la gentamicine.
   1. 1 heure après l’infection, retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez 0,1 ml de milieu macrophage contenant 0,1 mg/ml de gentamicine pour tuer les bactéries extracellulaires. Ajoutez de la gentamicine à tous les puits, même aux témoins non infectés, pour vous assurer que toutes les cellules sont traitées de la même manière. Transvasez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
6. Lavage des cellules.
   1. 2 heures après l’infection, retirez la plaque de l’incubateur et lavez tous les puits 2x avec 1 ml de DMEM ordinaire (préchauffé à 37 °C) et remplacez-le par un milieu macrophage (préchauffé à 37 °C) contenant 10 μg/ml de gentamycine pour empêcher la croissance de toute bactérie extracellulaire restante. Transvasez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
7. Préparation de tampons frais avec des détergents et des anticorps.
   1. Juste avant le moment d’analyse souhaité, préparer une solution mère fraîche de digitonine à 1 mg/ml dans un tampon KHM (110 mM d’acétate de potassium, 20 mM d’HEPES, 2 mM de MgCl₂, pH 7,3). Filtrer la substance et la diluer dans un tampon KHM jusqu’à une concentration de travail de 50 μg/ml de digitonine. De plus, préparer une solution de saponine à 0,1 % dans le tampon KHM, d’anticorps anti-Salmonella couplé à de l’isothiocyanate de fluorescéine (CSA-1-FITC) à 1/500, de l’anti-calnexine à 1/100 ou de la disulfure isomérase anti-protéique (anti-PDI) à 1/100 dans le tampon KHM complétée par de l’albumine sérique bovine à 3 % (BSA).
8. Perméabilisation cellulaire.
   1. Retirez la plaque de l’incubateur et lavez les puits 3 fois avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 °C). Retirer le tampon KHM et ajouter 0,25 ml de tampon KHM ordinaire aux puits A4 et B1/C1, un tampon KHM avec digitonine aux puits A1 - A3 et B2/C2, ou un tampon KHM avec saponine aux puits A5 et B3/C3 (conformément au tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à RT et laver immédiatement tous les puits 3 fois avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 °C).
9. Coloration primaire des anticorps.
   1. Retirer le tampon KHM et ajouter les solutions d’anticorps primaires (anti-Salmonella-FITC pour chèvres, 250 μl/puits, 0,1 μg/ml) dans les puits appropriés (figure 1, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Lavez les cellules 1x avec 1 mL de PBS.
10. Cellules infectées (puits A1 - A5) : analyse FACS
    1. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS et ajoutez 0,5 mL de PBS glacé contenant 0,1 % de Triton. Transférer dans un tube FACS de 5 mL muni d’un capuchon de crépine pour briser les agrégats cellulaires. Conservez les échantillons sur de la glace.
    2. Analysez les échantillons de FACS. À l’aide des commandes entièrement perméabilisées, réglez d’abord la porte pour les bactéries totales en fonction de la diffusion avant et latérale (FSC/SSC), et le signal mCherry (610 nm ± filtre 20 nm).
    3. Ensuite, analysez le signal FITC dans la population bactérienne totale à l’aide des contrôles entièrement perméabilisés et non perméabilisés pour définir les portes pour les bactéries cytosoliques (FITC+, mCherry+) et les bactéries vacuolaires (FITC-, mCherry+) (Figure 2).
    4. Une fois les portes définies, analysez les échantillons et déterminez le pourcentage de bactéries cytosoliques par rapport aux bactéries vacuolaires à l'aide du logiciel FlowJo selon le protocole du fabricant.

Tableau 1 : Schéma de placage pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) dans un format à 24 puits pour une infection ultérieure à Salmonella, la perméabilisation et la coloration.

		Perméabilisation		Coloration
	Lamelle en verre	salmonelle	Digitonine	saponine	anti-Salmonella	anti-Calnexine	anti-PDI
A1 (échantillon)	-/+*	+	+		+
A2 (échantillon)	-/+*	+	+		+
A3 (échantillon)	-/+*	+	+		+
A4 (pas de contrôle de la perméabilisation)	-/+*	+			+
A5 (contrôle complet de la perméabilisation)	-/+*	+		+	+
B1 (coloré pour la calnexine)	+					+
B2 (coloré pour la calnexine)	+		+			+
B3 (coloré pour la calnexine)	+			+		+
C1 (coloré pour PDI)	+						+
C2 (coloré pour PDI)	+		+				+
C3 (coloré pour PDI)	+			+			+

Résultats

Graphique 1. Représentation schématique du protocole 1. Les cellules infectées contenant des Salmonella mCherry-positives, soit dans des vacuoles intactes, soit dans le cytosol, sont perméabilisées différentiellement avec la digitonine. Les Salmonella cytosoliques sont colorées avec de l’anti-Salmonella couplé à la FITC. Les cellules sont lavées et lysées avec du Tri...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Digitonine	sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Technologies de la vie	Référence 15630
Acétate de potassium	sigma	791733
MgCl2	sigma	Référence M8266
Bsa	sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	Tél. : 01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	Référence 02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexine	Enzo Sciences de la vie	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Sciences de la vie	SPA-890	1/100
saponine	sigma	Réf. 47036
Support de montage Vectashield	Vectorlabs	H-1200
Anticorps anti-lapin-488	Sondes moléculaires	A-11070	1/500
gentamicine	Technologies de la vie	Référence 15710-49	100 ug/mL et 10 ug/mL
Triton X-100	Promega	N° H5141
Pbs	Gibco	Référence 20012-019
DMEM	sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	Technologies BD		détection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	Technologies BD		détection FITC 530 nm