Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation du tampon pour le prélèvement de sang humain et l’isolement des plaquettes lavées
- Préparez une solution aqueuse de 100 mL de citrate-dextrose acide (ACD) en dissolvant 1,4 g d’acide citrique monohydraté (C6H8O7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrate trisodique dihydraté (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) et 2 g de D(+)-glucose anhydre. Le pH de la solution est d’environ 4,5.
- Préparez les solutions mères pour le tampon de Tyrode comme suit
- Préparez la solution mère 1 en dissolvant 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 10 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et 0,58 g de dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH2PO4*H2O) dans 500 mL de H2O distillé. Les concentrations finales respectives sont de 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM et 8,4 mM. Maintenir la solution à 4 °C.
- Préparez la solution mère 2 en dissolvant 10,15 g de dichlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2*6 H2O) (100 mM) dans 500 mL d’eau distillée (H2O). Maintenir la solution à 4 °C.
- Préparer la solution mère 3 en dissolvant 10,95 g (100 mM) de chlorure de calcium hexahydraté CaCl2*6 H2O dans 500 mL de H2O distillé. Maintenir la solution à 4 °C.
- Préparez le tampon de Tyrode en diluant 2,5 mL de solution mère 1 dans un volume final de 50 mL avec du H2O distillé. Cela correspond à des concentrations finales de 136,5 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 11,9 mM de NaHCO3 et 0,42 mM de NaH2PO4*H2O. Ajustez le pH à 7,35 et stérilisez en filtrant avec des filtres de 0,22 μm.
- Préparez le tampon d'albumine à 0,35 % de Tyrode (tampon TA) en diluant 5 mL de solution mère 1, 1 mL de solution mère 2, 2 mL de solution mère 3, 0,5 mL de 1M HEPES, 1,8 mL de 200 g/L d'albumine sérique humaine et 0,1 g de D(+)-glucose anhydre dans un volume final de 100 mL de H2O distillé.
- Ajustez le pH à 7,35 avec de l’acide chlorhydrique (HCl) 1N et réglez l’osmolarité à 295 mOsm/L en ajoutant du H2O distillé (10 % du volume total). Les concentrations finales dans cette solution sont de 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4*H2O, 0,91 mM MgCl2*6 H2O, 1,82 mM CaCl2*6 H2O. Maintenir le tampon TA à 37 °C pendant toute la durée de l’expérience.
2. Prélèvement sanguin
- Prélever 45 à 50 ml de sang veineux, dans la veine antécubitale, à l’aide d’une aiguille de 19 G et d’un garrot ou d’un garrot faible, dans des tubes de 50 ml contenant un anticoagulant ACD (1 volume d’ACD pour 6 volumes de sang). Jetez les premiers 1 à 2 ml de sang pour éviter la présence de thrombine et de facteur tissulaire.
- Après le prélèvement, mélangez le sang avec l’ACD en inversant doucement le tube. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 37 °C.
3. Préparation des plaquettes humaines lavées
- Préchauffez la centrifugeuse à 37 °C. Toutes les étapes de centrifugation ci-dessous sont effectuées à cette température.
- Répartir le sang prélevé dans des tubes de 15 mL (5 mL par tube) et centrifuger à 250 x g pendant 13 min pour obtenir du plasma riche en plaquettes, le PRP.
note: Cette étape de centrifugation entraîne la production de trois couches dans l’échantillon : 1) La couche supérieure, composée de plasma, de plaquettes et d’une petite fraction de globules blancs. 2) La couche intermédiaire, une partie riche en globules blancs. 3) La couche inférieure, qui est essentiellement composée de globules rouges.
- Prélevez le PRP en pipetant soigneusement la couche supérieure dans un nouveau tube de 15 mL pour éviter au maximum la contamination par des globules rouges et blancs, et incubez pendant 10 min à 37 °C.
- Centrifuger le PRP à 2 200 x g pendant 12 min (pour 5 mL de PRP).
note: Cette étape de centrifugation doit être effectuée avec un frein bas ou sans frein.
- Retirer le surnageant (plasma pauvre en plaquettes) et remettre soigneusement la pastille en suspension avec 10 mL de tampon TA contenant 2 μL/mL d’héparine (5 000 U/mL) et 2,5 μL/mL de prostacycline 25 μM (IGP2) à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Ajouter 2,5 μL/mL de 25 μM de prostacycline-I2 (PGI2) et centrifuger pendant 8 min à 1 900 x g (avec frein bas ou sans frein).
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 5 mL de tampon TA contenant 2,5 μL/mL de 25 μM IGP2 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Pendant la période d’incubation, pipeter 150 μL de suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 mL et compter les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (qui détecte la taille des cellules sanguines en mesurant les changements de résistance au courant continu).
- Après l’incubation de 10 min, ajouter 2,5 μL/mL de 25 μM PGI2 à la suspension plaquettaire et centrifuger immédiatement à 1 900 x g pendant 8 min.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension à une concentration de 250 000 plaquettes/μL avec un volume adéquat de tampon TA (c.-à-d. si le nombre de cellules est de 500 000 par μL, remettre en suspension dans 10 mL de tampon TA) contenant 32 μL/mL d’apyrase à 0,01 U/mL (concentration finale 0,32 U/mL).
note: Une forte concentration d’apyrase est utilisée pour éviter la désensibilisation des récepteurs P2X purinoceptor 1, P2X1 induits par la sécrétion spontanée d’adénosine triphosphate (ATP) en l’absence d’agonistes. Ceci est important car les réponses induites par le collagène sont induites par l’activation paracrine/autocrine rapide de P2X1 par l’ATP libéré par les plaquettes activées. Si la voie de signalisation plaquettaire ne nécessite pas de manière critique la préservation de la fonction P2X1, utilisez 0,02 U/mL d’apyrase. Plusieurs études ont démontré que l’apyrase à 0,02 U/mL évite le récepteur ADP de l’adénosine diphosphate, le purinocepteur P2Y 1 et la désensibilisation P2Y1 avec des réponses P2X1 négligeables.
- Incuber la suspension cellulaire pendant au moins 30 min à 37 °C avant d’effectuer les mesures agrégées. La préparation est stable pendant 5 à 8 heures.
4. Agressivité
- Préparez du fibrinogène (56 mg/mL) dans le tampon de Tyrode.
- Pipeter 260 μL de suspension plaquettaire dans des cuvettes en verre (figure 1A ; cuvette de gauche) contenant 10 μL de fibrinogène (56 mg/mL) et une tige d’agitation magnétique, puis incuber la suspension pendant 2 à 3 min à 37 °C dans les puits d’incubation présents dans l’agrégateur (figures 1B et 1C).
- Pré-incuber avec l’inhibiteur de Panx1 Brilliant Blue FCF en ajoutant 10 μL d’une solution mère de 2,8 mM ou 28 mM (concentration finale de 100 μM et 1 mM, respectivement) pendant 7 min à 37 °C.
- Étalonnez l’agrégatomètre à une valeur d’agrégation supposée de 100 % en mesurant la densité optique (DO) d’une cuvette contenant 10 μL de fibrinogène (56 mg/mL), 10 μL de bleu brillant FCF (2,8 mM ou 28 mM) et un tampon TA sans plaquettes.
- Placez la cuvette dans un puits d’agrégation sous agitation automatique et appuyez sur le bouton correspondant du clavier de l’ordinateur relié à l’agrégateur (c’est-à-dire appuyez sur F1 si le puits d’agrégation 1 est utilisé).
note: Cette expérience décrite ci-dessous inclut Brilliant Blue FCF. Le composé utilisé pour l’étalonnage doit être adapté aux conditions expérimentales.
- Étalonnez l’agrégatomètre à une valeur d’agrégation supposée de 0 % en utilisant le même échantillon de plaquettes que celui qui sera utilisé pour l’expérience sous agitation automatique.
- Placez la cuvette dans le puits d’agrégation et appuyez sur le bouton correspondant sur le clavier de l’ordinateur relié à l’agrégateur. Attendez environ 20-30 s avant de continuer. Ce délai permet de s’assurer qu’aucune agrégation n’a lieu avant l’ajout des agonistes.
note: Comme toute différence dans le nombre de plaquettes peut avoir un effet sur la DO mesurée, l’étape d’étalonnage à 0 % doit être répétée pour chaque mesure individuelle.
- Ajoutez 20 μL d’agoniste souhaité, tel que 15 μg/mL de collagène (1 μg/mL final) ou 1,125 mM d’acide arachidonique (75 μM final), dans la cuvette. Démarrez immédiatement l’enregistrement sous agitation automatique continue en appuyant sur le bouton correspondant du clavier de l’ordinateur relié à l’agrégateur.
note: L’ajout de l’agoniste induit l’activation plaquettaire. Les agrégats plaquettaires sont clairement distingués dans la cuvette en verre à la fin de l’expérience (Figure 1A ; cuvette de droite).
- L’enregistrement s’arrête automatiquement au bout de 6 min. À ce stade, enregistrez les données en cliquant sur l’icône d’enregistrement sur l’ordinateur.
note: Le calcul du taux d’agrégation est effectué par l’ordinateur, qui exprime les résultats finaux du processus d’agrégation en pourcentage.
