REMARQUE : Toutes les étapes décrites aux sections 1 et 2 sont effectuées dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire.
1. Maintenance de U87. Cellules CD4.hCXCR4
- Cultivez les cellules dans des flacons de culture T75 à 37°C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
note: La lignée cellulaire in vitro utilisée dans ce protocole est une lignée cellulaire de glioblastome U87 exprimant de manière stable le cluster de différenciation 4 (CD4) et le récepteur 4 des chimiokines CXC humaines (CXCR4) et a été décrite précédemment. L’expression cellulaire à la surface de CD4 et CXCR4 est surveillée en permanence par cytométrie en flux et les niveaux d’expression restent constants dans le temps (~ 100 % de cellules CD4+ et ~ 100 % de cellules CXCR4+). Une description détaillée de la génération de la lignée cellulaire utilisée et de la procédure de cytométrie en flux pour étudier les niveaux d’expression des récepteurs n’entre pas dans le cadre de ce protocole.
- Cellules de sous-culture à 80-85 % de confluence. Laissez tous les réactifs atteindre la température ambiante (RT) avant la culture cellulaire.
- Retirez le milieu de culture conditionné des cellules et lavez une fois la monocouche cellulaire avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 3 ml d’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique à 0,25 % (trypsine-EDTA) et répartir uniformément le tout sur la monocouche cellulaire. Retirez ensuite l’excès de trypsine-EDTA et incubez jusqu’à 5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher.
- Ajouter 10 mL de milieu de croissance complet frais (milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + 0,01 M d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) + agents de sélection appropriés). Remettez les cellules en suspension en les pipetant doucement de haut en bas. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 50 ml.
- Comptez le nombre de cellules viables à l’aide d’une méthode de votre choix. Dans le cas des cellules de glioblastome U87, la viabilité atteint généralement ~ 100 %.
note: Les numéros de cellule peuvent être déterminés de plusieurs façons. Nous utilisons régulièrement un système d’analyse cellulaire automatisé basé sur la coloration au bleu de trypan (voir le tableau des matériaux) conformément à ses procédures de manipulation standard, mais d’autres méthodes devraient fonctionner tout aussi bien.
- Ajouter 2 cellules 106 ou 3 x 106 cellules (viables) à un volume final de 25 mL de milieu de culture frais dans une fiole de culture T75 et incuber à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
note: Si 3 x 106 cellules sont utilisées, les cellules atteindront 80-90 % de confluence après 2 jours. Si 2 x 106 cellules sont utilisées, elles atteindront la même confluence après 3 jours. Le taux de croissance des cellules doit d’abord être déterminé empiriquement si d’autres lignées cellulaires sont utilisées.
2. Ensemencement des cellules pour le test de mobilisation Ca2+
- Le jour du passage des cellules (jour 0), enduire les plaques de polystyrène à 96 puits à parois noires avec des fonds transparents (voir le tableau des matériaux) d’une solution de gélatine à 0,1 % pour faciliter la fixation des cellules.
note: Le revêtement des plaques à 96 puits avec de la gélatine peut être omis si des plaques pré-enduites, qui sont disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux), sont utilisées. Il est recommandé d’évaluer l’utilisation de plaques pré-enduites au lieu d’un revêtement manuel pour chaque lignée cellulaire étudiée avant de poursuivre avec le protocole.
- Préparez une solution de gélatine en ajoutant 1 g de gélatine à 100 ml de PBS pour obtenir une solution à 1 %. Diluer 10x avec du PBS avant de poursuivre l’utilisation. Pour améliorer la solubilité de la gélatine, chauffer la solution à 37 °C.
- Ajouter 100 μL de solution de gélatine à 0,1 % par puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incubation pendant 2 h à RT.
- Pendant ce temps, préparez les cellules pour l’ensemencement dans la plaque enduite de 96 puits.
- Détachez les cellules du ballon de culture, mettez-les en suspension dans le milieu de croissance frais et comptez-les à l’aide de la méthode de coloration au bleu de trypan.
- Faites tourner les cellules dans un tube de 50 mL pendant 5 min à 400 x g à RT.
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu de croissance frais (DMEM + 10 % FBS + 1 % HEPES, sans antibiotiques) pour obtenir une densité cellulaire de 0,1 x 106 cellules (viables) par mL.
- Retirez la solution de gélatine des plaques à parois noires à fond transparent en retournant la plaque et en la séchant sur un mouchoir. Ajoutez 200 μL/puits de PBS pour enlever l’excès de gélatine et retournez à nouveau la plaque.
- Distribuer 200 μL de suspension cellulaire (correspondant à 0,2 x 105 cellules) par puits dans la plaque à 96 puits recouverte de gélatine (ci-après dénommée « plaque de mesure »).
- Incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
3. Chargement des cellules avec un colorant fluorescent sensible au Ca2+
- Le jour 1, effectuez le test de mobilisation du Ca2+ proprement dit, en commençant par le chargement des cellules ensemencées avec le colorant fluorescent de liaison au Ca2+ fluo-2 acétoxyméthyle (fluo-2 AM).
- Préparez le tampon de dosage en ajoutant 40 mL de HEPES (1 M) à 200 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS, 10x, sans rouge de phénol, sans bicarbonate de sodium). Ajouter de l’eau ultra-pure pour obtenir un volume final de 2 L et ajouter 4 g d’albumine sérique bovine (BSA). Dissoudre le BSA par agitation magnétique. Ajustez le pH à 7,4 (avec de l’hydroxyde de sodium, NaOH) et filtrez la solution.
note: Au cours de toutes les étapes suivantes, le même tampon, appelé « tampon d’essai », est utilisé.
- Préparez une solution mère (4 mM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO)) du colorant fluorescent sensible au Ca2+ fluo-2 AM. Évitez une exposition excessive à la lumière. Dissoudre 1 mg de fluo-2 AM (poids moléculaire : 1 061 g/mol) dans 235,6 μL de DMSO.
- Préparez une solution de travail de fluo-2 AM. Pour une plaque d’essai à 96 puits, mélanger 12,5 μL de solution mère de fluo-2 AM (4 mM) et 12,5 μL de solution de polyol de surfactant non ionique (p. ex., pluronic f-127) (20 % poids/volume dans le DMSO, voir le tableau des matériaux). Ajouter 22 μL de ce mélange à 11 mL de tampon de dosage dans un tube de 15 mL. La concentration finale de fluo-2 AM est de 4 μM.
note: Le tensioactif non ionique est utilisé comme agent de dispersion pour améliorer la solubilité aqueuse du fluo-2 AM et, par conséquent, pour améliorer la charge cellulaire. Pour solubiliser le tensioactif dans le DMSO, chauffer l’échantillon à 37 °C et mélanger régulièrement pour obtenir une solution homogène.
- Retirez le milieu de croissance des cellules précédemment ensemencées dans la plaque de mesure de 96 puits en retournant la plaque et en la séchant sur une serviette en papier.
- Ajouter 100 μL de solution de colorant de chargement par puits à l’aide d’une pipette multicanaux et incuber pendant 45 min à RT dans l’obscurité.
4. Préparation de plaques de polypropylène à 96 puits contenant le ligand de chimiokine CXC 12 (CXCL12) ou les composés à l’étude
- Procurez-vous des plaques de polypropylène (PP) à fond rond à 96 puits (voir le tableau des matériaux).
- Laisser la solution mère de CXCL12 (1 mg/mL) et la solution mère des composés étudiés s’équilibrer à RT.
note: La solution mère de CXCL12 est préparée dans de l’eau ultrapure additionnée de 0,01 % de Tween20 et stockée à -20 °C sous forme d’aliquotes à usage unique.
- Préparer une solution concentrée 5 fois de CXCL12 dans un tampon de dosage (250 ng/mL, ce qui équivaut à 31,25 nM) et une dilution concentrée 5 fois plus concentrée de chaque composé (dans un tampon de dosage).
- Distribuez les solutions mères dans la plaque à 96 puits appropriée selon une disposition de plaque prédéfinie. Distribuer 75 μL/puits dans la plaque contenant CXCL12 (la « plaque de chimiokine ») et distribuer 50 μL/puits dans la plaque contenant les composés (la « plaque composée »).
note: Les deux composés et le CXCL12 seront finalement dilués 5 fois lors de la distribution dans la plaque de mesure. Il est également important d’inclure des puits de contrôle négatifs ne contenant que du tampon de dosage dans la plaque composée ainsi que dans la plaque de chimiokine. De plus, des puits de contrôle positif doivent être inclus (c’est-à-dire des puits avec CXCL12 dans la plaque de chimiokine, mais avec un tampon de dosage dans les puits correspondants de la plaque composée).
5. Paramètres de protocole sur le lecteur de microplaques à fluorescence
REMARQUE : Le lecteur de microplaques à fluorescence utilisé dans ce protocole est mentionné dans la Table des matériaux.
- Allumez d’abord l’unité de refroidissement du lecteur de plaques de fluorescence, puis allumez le lecteur de fluorescence lui-même. Laissez démarrer pendant quelques minutes et ouvrez le logiciel du système.
- Créez le protocole du test à l'aide du menu glisser-déposer qui comprend les étapes suivantes :
- Dans la boîte « Paramètres », sélectionnez « Read_Mode » avec la longueur d'onde d'excitation : 470-495 nM et la longueur d'onde d'émission : 515-575 nM.
note: Les longueurs d’onde sélectionnées sont appropriées pour une utilisation avec le colorant fluo2 sensible au Ca2+.
- Inclure la boîte « Mix with TF » (fluide de transfert) pour le mélange automatique des composés dans la plaque de composé, qui sera placée à la source 2 positions de l’appareil (voir étape 6.4). Sélectionnez 15 μL de solution dans chaque puits à aspirer et à mélanger automatiquement trois fois. Réglez la hauteur des pointes de pipette à 20 μL sous la surface du liquide. Réglez la vitesse d’aspiration et de distribution à 50 μL/s.
note: La hauteur des pointes de pipette fait référence au volume qui reste sous les pointes de pipette. Par exemple, si les puits d’une plaque composée contiennent 50 μL, une hauteur de 30 μL correspond à 20 μL sous la surface du liquide. Le volume de solution composée nécessaire pour mélanger, la vitesse de mélange, la position des pointes de pipette pendant le mélange et le nombre de cycles de mélange peuvent tous être ajustés à l’aide du logiciel.
- Dans la case « Fluide de transfert », indiquez que 20 μL de chaque puits de la plaque composée seront transférés dans la plaque de mesure. Positionnez les pointes de pipette à 20 μL sous la surface du liquide, c’est-à-dire à une hauteur de 30 μL lors de l’aspiration des composés et à une hauteur de 60 μL lors de la distribution dans la plaque de mesure. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 μL/s et la vitesse de distribution à 25 μL/s.
note: La plaque composée contient 50 μL de solution par puits (voir étape 4.1.3), donc une hauteur de 30 μL correspond à une position à 20 μL sous la surface du liquide. La plaque de mesure contiendra 80 μL de tampon de dosage par puits (voir étape 6.3), donc une hauteur de 60 μL correspond à une position similaire des pointes.
- Sélectionnez le bouton « Lire avec TF ». Au cours du premier intervalle, sélectionnez 60 lectures (mesures fluorescentes) avec un temps d’intervalle de lecture de 1 s. Définissez que 10 lectures sont enregistrées avant de distribuer les composés dans la plaque de mesure, et 50 lectures ensuite. Définissez le deuxième intervalle avec un intervalle de lecture de 30 secondes et 18 lectures.
note: Au cours de cette étape, la fluorescence sera mesurée cinétiquement (aux intervalles de temps définis) pendant ~ 10 min au total.
- Incluez le bouton « Conseils de lavage » dans le protocole à trois reprises. Au sein de chaque étape de lavage, sélectionnez le type de fluide : fluide A (eau ultrapure) ou fluide B (éthanol à 70 %), le nombre de cycles de lavage (1), la vitesse de la pompe (rapide) et le nombre de passages (5) lors de chaque étape de lavage.
note: Au cours de la première et de la dernière étape de lavage, le liquide A est utilisé, au cours de la deuxième étape de lavage, le liquide B est utilisé.
- Incluez la fonction « Pause Pipettor ». Réglez la pipette sur une pause de 300 s.
note: En incluant cette étape dans le protocole, la tête de la pipette, qui est intégrée dans le dispositif de lecture de plaques de fluorescence, fera une pause de 5 minutes avant de poursuivre le protocole.
- Inclure la case « Mix with TF » pour permettre le mélange automatique de la solution CXCL12 dans la plaque de chimiokine, qui sera positionnée à la position source 3 de l’appareil (voir étape 6.4). Sélectionnez 15 μL de solution dans chaque puits à aspirer et à mélanger automatiquement trois fois. Pendant l’aspiration et le mélange, placez les pointes de la pipette à 20 μL sous la surface du liquide. La vitesse d’aspiration et de distribution est réglée à 50 μL/s.
note: Comme à l’étape 5.2.2, ces paramètres peuvent être ajustés.
- Dans la case « Fluide de transfert » suivante, indiquez que 25 μL de chaque puits de la plaque de chimiokine seront transférés dans la plaque de mesure. Positionnez les pointes à 20 μL sous la surface du liquide, c’est-à-dire à une hauteur de 55 μL lors de l’aspiration à partir de la plaque de chimiokine contenant 75 μL/puits (voir étape 4.1.3), et à une hauteur de 80 μL lors de la distribution dans la plaque de mesure. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 μL/s et la vitesse de distribution à 25 μL/s.
- Incluez le bouton « Lire avec TF ». Au cours du premier intervalle, sélectionnez 145 lectures avec un intervalle de lecture de 1 s. Définissez que 5 lectures sont enregistrées avant de distribuer CXCL12 dans la plaque de mesure, et 140 lectures par la suite. Définissez le deuxième intervalle avec un temps d’intervalle de lecture de 6 s et sélectionnez 20 lectures.
note: Au total, tout au long du protocole, 243 lectures (mesures fluorescentes) sont enregistrées : 78 à l’étape 5.2.4 et 165 à l’étape 5.2.9.
- Comme à l’étape 5.2.5, incluez le bouton « Astuces de lavage » trois fois dans le protocol.
note: L’inclusion de cette étape à la fin du protocole permet de réutiliser les pointes pour effectuer un autre test sans avoir à changer les pointes.
- Réglez la température de l’appareil à 37 °C en cliquant sur le bouton « Régler la température de la scène » et en sélectionnant 37 °C.
6. Exécution du test de fluorescence
- Une fois que la plaque de mesure a été incubée avec un tampon de chargement pendant 45 min (voir étape 3.1.5), retirez le tampon en retournant la plaque et séchez-la sur un mouchoir en papier.
- Lavez les cellules ensemencées en ajoutant 150 μL/puits de tampon de dosage et incubez pendant 2 min.
- Retirez à nouveau le tampon en retournant la plaque. Ajouter 80 μL/puits de tampon de dosage à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Placez toutes les plaques dans l’appareil à leur position appropriée : la plaque composée en position source 2, la plaque de chimiokine en position source 3 et la plaque de mesure en position lecture. Mettez une boîte d’embouts noirs à la position de la source 1 embouts. Fermez la porte de l'appareil et incubez pendant 5 min avant de continuer le protocole.
- Sélectionnez le bouton « Test de signal de protocole » pour déterminer les unités de lumière relative d’arrière-plan (RLU) et la variance de fluorescence sur la plaque. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Sélectionnez « Signal de test ».
note: Au cours de cette étape, les RLU d’arrière-plan sont déterminées par la caméra ICCD (Intensifiedd Charge-Coupled Device), qui est intégrée dans le compartiment optique du lecteur de fluorescence. Ces RLU résultent de l’excitation du colorant sensible au Ca2+ (fluo-2) par des diodes électroluminescentes (LED) (longueur d’onde de sortie des LED 470-495 nm). Des valeurs de 8 000 à 10 000 RLU sont bien adaptées à cette application. Les RLU peuvent, si nécessaire, être adaptés en modifiant l’intensité d’excitation (Select Exc. Intensity) ou la porte de la caméra (Select Gate Open). L’écart sur la plaque doit idéalement être inférieur à 7,5 %.
- Sélectionnez « Mettre à jour » si des valeurs d’arrière-plan de 8 000 à 10 000 RLU sont obtenues. Enregistrez le protocole principal en cliquant sur le bouton Enregistrer.
note: Ce faisant, les paramètres du test de signal du protocole seront transférés au protocole principal.
- Exécutez le test en appuyant sur le bouton « RUN ».
