1. Récolte cellulaire et mesure de l’activité de la α-galactosidase A ou de la α-glucosidase acide
- Récolte de cellules
- Le jour de la récolte, retirez les cellules de l’incubateur et aspirez le milieu. Laver soigneusement les cellules 2 fois avec du PBS avec Ca2+ et Mg2+.
REMARQUE : Cette étape est essentielle car DGJ et DNJ sont de puissants inhibiteurs de la α-galactosidase et de la α-glucosidase, respectivement, et tout résidu invaliderait le test.
- Ajoutez 200 μL d’eau déminéralisée directement sur les cellules. Rincez les cellules de la plaque et transférez-les dans un tube de réaction de 1,5 ml.
2. Homogénéisation par congélation et décongélation
- Placez les échantillons dans un support à mousse approprié et vortex pendant 5 s pour rendre la lyse plus efficace. Mettre les échantillons en alternant dans de l’azote liquide pendant 10 s et dans un bain-marie à température ambiante jusqu’à ce que la décongélation soit complète (5 min).
- Répétez cette procédure 5 fois, puis faites tourner les échantillons pendant 5 min à 10 000 x g. Conservez le surnageant et pipetez dans un nouveau tube de réaction.
3. Détermination de la concentration en protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA)
- Préparez un tube frais pour chaque échantillon contenant 40 μL de H2O désionisé et ajoutez 10 μL de l’échantillon. Mélanger la solution en utilisant brièvement un vortex et transférer 10 μL dans une cavité d’une plaque à 96 puits (chaque échantillon en trois exemplaires). Diluer une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 mg/mL dans du H2O désionisé comme suit pour obtenir une courbe standard : 50 μL H2O/50 μL BSA ; 60 μLH 2O/40 μL BSA ; 70 μL H2O/30 μL BSA ; 80 μL H2O/20 μL BSA ; 90 μL H2O/10 μL BSA ; 100 μL H2O.
- Démarrer la réaction en ajoutant 200 μL de réactif BCA (réactif A et réactif B mélangés dans un rapport de 50:1) et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à 37 °C sous une légère agitation sur un agitateur orbital (300 tr/min). Mesurer l’absorbance à 560 nm dans un lecteur de plaques.
note: Les échantillons contiennent généralement entre 1 et 1,5 μg de protéines par μL.
4. Mesure de l’activité enzymatique avec des substrats artificiels de 4-méthylumbellifère (4-MUG)
- Diluer la quantité calculée de chaque échantillon et pipeter dans des tubes de réaction frais de 1,5 mL pour obtenir 0,05 μg (pour la α-galactosidase A) ou 0,5 (pour la α-glucosidase acide) μg de protéines/μL. Vortex à nouveau les échantillons pendant 5 s et pipeter 10 μL de cette dilution dans une plaque de 96 puits (chaque échantillon en double).
- Démarrez la réaction en ajoutant 20 μL de la solution de substrat correspondante :
Pour la α-galactosidase A : 2 mM de 4-méthylumbelliféryl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) dans un tampon de citrate de phosphate 0,06 M, pH 4,7.
Pour la α-glucosidase acide : 2 mM de 4-méthylumbellifèreryl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) dans de l’acétate de sodium 0,025 M, pH 4,0.
- Incuber les réactions enzymatiques pendant 1 h dans l’obscurité à 37 °C sous une légère agitation sur un agitateur orbital (300 tr/min). Terminez la réaction par l’ajout de 200 μL de tampon glycine-NaOH ajusté à 1,0 M, pH 10,5.
- Préparer une courbe standard de 4-méthylumbellifère (4-MU) à partir d’une masse mère de 0,01 mg/mL comme suit :
100 μL H2O/ pas de 4-MU ; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU ; 60 μLH 2O/ 40 μL 4-MU ; 40 μLH 2O/ 60 μL 4-MU ; 20 μLH 2O/ 80 μL 4-MU ; pas de H2O/ 100 μL 4-MU, pipeter 10 μL de chaque dilution dans la plaque à 96 puits (en doubles) et ajouter 200 μL du tampon glycine-NaOH 1,0 M dans chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH.
- Mesurez l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du jeu de filtres approprié et analysez les données à l’aide du logiciel approprié pour le lecteur de fluorescence.
note: Les deux substrats de 4-MUG sont réduits en 4-MU lors de l’exposition à la α-galactosidase A ou à la α-glucosidase acide. Le 4-MU libéré est un fluorochrome, qui peut être mesuré à 360 et 465 nm comme longueurs d’onde d’excitation et d’émission, respectivement, à l’aide d’un lecteur de fluorescence de microplaques.
