Évaluation de l’efficacité d’un composé d’essai antiviral au moyen d’un essai d’inactivation virale

1. Essai d’inactivation virale

Remarque : Des exemples de période d’incubation et de dose virale pour divers virus sont énumérés à la figure 1A. Des concentrations plus élevées du virus peuvent également être testées en augmentant le MOI/PFU.

1. Semez des cellules Huh-7.5 dans une plaque de 96 puits (1 × 10⁴ cellules par puits) et incubez à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ O/N pour obtenir une monocouche.
2. Incuber les composés d’essai ou les témoins (concentrations finales : CHLA = 50 μM ; PUG = 50 μM ; héparine = 1 000 μg/ml ; DMSO = 1 %) avec les particules HCV à 37 °C (Figure 1A, « Long terme ») dans un rapport de 1:1. Par exemple, à un inoculum de virus de 100 μl contenant 1 x 104 UFC, ajouter 100 μl d’une dilution de travail CHLA de 100 μM ; cela donne un traitement CHLA à une concentration finale de 50 μM.
3. Diluer le mélange virus-médicament jusqu’à une concentration « sous-thérapeutique » (inefficace) des composés d’essai. Par exemple, la concentration inefficace de CHLA et de PUG contre le VHC est de 1 μM31 ; par conséquent, cela nécessite une dilution de 50 fois du mélange virus-médicament, ce qui peut être réalisé avec 9,8 ml de milieu basal (milieu de culture cellulaire avec 2 % de FBS).
   Remarque : La dilution jusqu’à la concentration sous-thérapeutique empêche une interaction significative entre les composés testés et la surface de la cellule hôte et permet d’examiner l’effet du traitement sur les virions acellulaires. Il convient de noter que cette dilution dépend de la relation dose-réponse antivirale des composés d’essai contre l’infection virale particulière et qu’elle est déterminée avant d’effectuer cet essai.
4. À titre de comparaison, mélanger le virus avec les composés d'essai et diluer immédiatement (sans période d'incubation) jusqu'à la concentration sous-thérapeutique avant l'infection (figure 1A, « à court terme »).
5. Ajouter 100 μl du mélange dilué de médicament contre le VHC sur la monocouche de cellules Huh-7,5 (la quantité de virus est maintenant de 1 x 10² UFC ; MOI final = 0,01) et incuber pendant 3 heures à 37 °C pour permettre l’adsorption virale.
6. Après l’infection, retirez l’inoculum dilué et lavez doucement les puits avec 200 μl de PBS deux fois.
   note: Effectuez les lavages en douceur pour éviter de soulever les cellules.
7. Appliquer 100 μl de milieu de base dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 72 heures.
8. Analysez l’infection résultante en dosant l’activité de la luciférase dans le surnageant.

Graphique 1. Inactivation des infections virales par les composés d’essai CHLA et PUG. Différents virus ont été traités avec les composés d’essai pendant une longue période (incubation pendant 1,5 à 3 heures avant titrage ; barres gris clair) ou une courte période (immédiatement dilué ; barres gris foncé) à 37 °C avant une dilution jusqu’à une concentration sous-thérapeutique et une analyse ultérieure de l’infection sur les cellules hôtes respectives. (A) Schémas de l’expérience (illustrés à gauche) avec la concentration finale du virus (PFU/puits ou MOI), la période d’incubation à long terme du virus-médicament (i) et la durée d’incubation subséquente (ii) indiquées pour chaque virus dans le tableau de droite. Les analyses pour (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV et (F) RSV sont indiquées dans chaque panneau supplémentaire. Les résultats sont comparés au traitement témoin négatif au DMSO pour l’infection virale et les données présentées sont les moyennes ± erreurs-types de la moyenne (SEM) de trois expériences indépendantes. Cette figure a été modifiée par rapport à la référence.