Remarque : Assurez-vous que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et l’infection virale sont effectuées dans des cagoules de biosécurité certifiées qui conviennent au niveau de biosécurité des échantillons manipulés. Aux fins de la description des protocoles, le VHC marqué par un rapporteur de Gaussia luciferase est utilisé comme virus modèle. Dans le contexte des résultats représentatifs, les composés acide chébulagique (CHLA) et punicalagine (PUG) sont utilisés comme antiviraux candidats qui ciblent les interactions des glycoprotéines virales avec les glycosaminoglycanes de surface cellulaire au cours des premières étapes d’entrée virale. L’héparine, qui est connue pour interférer avec l’entrée de nombreux virus, est utilisée comme traitement de contrôle positif dans un tel contexte.
1. Culture cellulaire, préparation de composés et cytotoxicité des composés
- Cultivez la lignée cellulaire respective pour le système d’infection virale à analyser (tableau 1). Pour le VHC, cultivez les cellules Huh-7,5 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 200 U/ml de pénicilline G, 200 μg/ml de streptomycine et 0,5 μg/ml d'amphotéricine B.
- Préparez les composés d’essai et les témoins à l’aide de leurs solvants respectifs : par exemple, dissoudre l’ALCH et le PUG dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) ; préparer de l’héparine dans de l’eau stérile bidistillée. Pour toutes les dilutions subséquentes, utilisez le milieu de culture.
Remarque : La concentration finale de DMSO dans les traitements des composés d’essai est inférieure à 1 % dans les expériences ; 1 % de DMSO est inclus comme traitement témoin négatif dans les essais à des fins de comparaison.
- Déterminer la cytotoxicité des composés d’essai (p. ex., CHLA et PUG) sur les cellules de l’infection virale à l’aide d’un réactif déterminant la viabilité cellulaire tel que l’hydroxyde de 2,3-bis[2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl]-5-phénylamino)-carbonyl]-2H-tétrazolium) :
- Pour le VHC, ensemencer des cellules Huh-7,5 dans une plaque de 96 puits (1 × 104 cellules par puits) et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 O/N pour obtenir une monocouche.
- Appliquer le témoin DMSO (1 %) ou des concentrations croissantes des composés d’essai CHLA et PUG (p. ex. 0, 10, 50, 100 et 500 μM) dans les puits de culture en trois exemplaires.
- Incuber à 37 °C pendant 72 heures, puis jeter le milieu dans la plaque et laver les cellules avec 200 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois.
- Ajoutez 100 μl de solution de dosage du kit de test toxicologique in vitro basé sur XTT dans chaque puits et incubez les plaques à 37 °C pendant 3 heures supplémentaires pour permettre la production de formazan XTT.
- Déterminer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’essai de 492 nm et à une longueur d’onde de référence de 690 nm.
- Calculer le pourcentage de cellules survivantes à l'aide de la formule suivante : viabilité cellulaire ( %) = At / As × 100 %, où « At » et « As » font référence à l'absorbance des composés d'essai et aux traitements de contrôle du solvant (ex. 1 % de DMSO), respectivement. Déterminez la concentration de cytotoxicité cellulaire à 50 % (CC50) des composés d'essai à l'aide d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism conformément au protocole du fabricant.
2. Lecture de l’infection virale
Remarque : La lecture de l’infection virale dépend du système viral utilisé et peut impliquer des méthodes telles que des tests de plaque ou la mesure des signaux rapporteurs des virus marqués par rapporteur. La méthode de détection de l’infection par le VHC rapporteur basée sur l’activité déclarante de la luciférase est décrite ci-dessous.
- Prélever les surnageants dans les puits infectés et clarifier à 17 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 °C.
- Mélangez 20 μl de surnageant de test à 50 μl de substrat de luciférase du kit de dosage de la luciférase Gaussia et mesurez directement avec un luminomètre selon les instructions du fabricant.
- Exprimer l'infectiosité du VHC en log10 unités de lumière relative (RLU) pour déterminer l'inhibition virale ( %) et calculer la concentration efficace de 50 % (EC50) des composés d'essai contre l'infection par le VHC à l'aide d'algorithmes du logiciel GraphPad Prism selon le protocole du fabricant.
3. Essai d’entrée/fusion virale
Remarque : Des exemples de périodes d'incubation et de doses virales pour divers virus sont répertoriés dans la figure 1A 'Entrée/Fusion'. Des concentrations plus élevées du virus peuvent également être testées en augmentant le MOI/PFU.
- Ensemencez des cellules Huh-7.5 dans une plaque de 96 puits (1 × 104 cellules par puits), et incubez à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 O/N pour obtenir une monocouche.
- Pré-refroidir les monocouches cellulaires dans des plaques à 4 °C pendant 1 h.
- Infecter les cellules avec le VHC (multiplicité de l’infection, MOI = 0,01) à 4 °C pendant 3 heures. Par exemple, utilisez un inoculum de virus de 100 μl contenant 1 x 102 unités formeuses de foyer (FFU).
note: Effectuer l’ajout de l’inoculum viral sur de la glace et l’incubation qui s’ensuit dans un réfrigérateur à 4 °C pour maintenir la température à 4 °C, ce qui permet la liaison virale mais pas l’entrée.
- Retirez le surnageant et lavez délicatement les monocouches cellulaires avec 200 μl de PBS glacé deux fois.
note: Effectuez les lavages en douceur pour éviter de soulever les cellules.
- Traiter les puits à l’aide des composés d’essai ou des témoins (les concentrations finales sont : CHLA = 50 μM ; PUG = 50 μM ; héparine = 1 000 μg/ml ; DMSO = 1 %) et incuber à 37 °C pendant 3 heures. Par exemple, ajouter 10 μl d’une dilution de travail CHLA de 500 μM à 90 μl de milieu, mélanger et traiter les puits ; cela permet d’obtenir un traitement CHLA à une concentration finale de 50 μM.
note: Le passage de 4 °C à 37 °C facilite désormais l'entrée virale ou l'événement de fusion et permet donc d'évaluer l'effet des composés testés sur cette étape particulière.
- Aspirer le surnageant contenant le médicament et éliminer les virus extracellulaires non internalisés en les lavant avec 200 μl de tampon de citrate (50 mM de citrate de sodium, 4 mM de chlorure de potassium, pH 3,0) ou de PBS. Appliquer 100 μl de milieu de base avant l’incubation à 37 °C pendant 72 heures.
- Analysez l'infection résultante en dosant l'activité de la luciférase dans le surnageant, comme décrit en '2. lecture de l'infection virale ».
