Détection colorimétrique d’un biomarqueur bactérien à l’aide d’un test décisif modifié

Résumé

Source : Tram, K., et al. Détection colorimétrique de bactéries à l’aide du test Litmus. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente une méthode de détection colorimétrique d’E. coli, impliquant un biomarqueur d’E. coli activant un DNAzyme, conduisant à un clivage de la liaison ARN et au détachement d’un conjugué DNAzyme-uréase. Un test colorimétrique ultérieur détecte le biomarqueur d’E. coli grâce aux changements de pH induits par l’ammoniac.

Protocole

1. Préparation des cellules E. coli pour les tests

1. Pour obtenir la suspension cellulaire souhaitée, transférez 1 ml de stock cultivé dans un tube à microfuge de 1,5 ml.
2. Centrifugez les cellules à 6 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
3. Ajoutez 10 μl de tampon de réaction à la pastille cellulaire et remettez les cellules en suspension. Sonicer la suspension cellulaire pendant 5 min. Transférez la suspension cellulaire dans une glacière pendant 5 min.
4. Soniquer la suspension cellulaire pendant encore 5 min.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Utiliser le surnageant pour le test (10 μl).

2. Test décisif

1. Dans un tube à microfuge de 1,5 ml, prélaver le tube en ajoutant et en vortexant 100 μl de tampon de réaction (RB) dans le tube à microfuge et en jetant le tampon.
2. Transférez 15 μl d’EC1 assemblé dans le tube microfuge lavé.
3. Lavez les billes magnétiques en plaçant le tube microfuge sur un support magnétique. Retirer le surnageant par pipetage. Retirez le tube microfuge du rack, ajoutez 100 μl de RB et remettez soigneusement les billes magnétiques en suspension.
4. Lavez le MB deux fois de plus en répétant l’étape 2.3.
5. Replacez le tube de microfuge sur le support magnétique, retirez le surnageant et ajoutez l’échantillon de 10 μl d’E. coli préparé à l’étape 1.3.
6. Mélangez soigneusement l’échantillon et les billes magnétiques en tapotant doucement sur le tube du microfuge.
7. Incuber la réaction à température ambiante pendant 1 heure.
8. Pour la réaction, ajoutez 90 μl de ddH₂O et placez le tube microfuge sur une grille magnétique.
9. Après environ 3 minutes de séparation magnétique, transférez soigneusement 85 μl du surnageant dans un tube microfuge de 0,5 ml. Retirez lentement le surnageant pour éviter de collecter des billes magnétiques.
10. Au tube de microfuge ci-dessus, ajoutez 15 μl de rouge de phénol à 0,04 % et 100 μl de solution de substrat.
11. Prenez une photo à des intervalles de temps précis pour enregistrer le changement de couleur.
    note: Le changement de pH peut également être surveillé à l’aide d’un pH-mètre avec une microélectrode. Le pH de départ doit être d’environ 5,2-5,5 (la solution est jaune). Sinon, la solution peut être ajustée par l’ajout de 1 mM de tampon d’acétate pH 5,0).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	VWR AMRESCO	105
Pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH)	BIO BASIC CANADA INC	Réf. SB6789
Tris-base	VWR AMRESCO	497
urée	VWR AMRESCO	M123
Xylènecyanol FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
0,04 % rouge de phénol	SIGMA-ALDRICH	Réf. P3532
10x tampon de réaction polynucléotidique kinase T4	Lucigen	Référence 30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Perle magnétique (BioMag)	Laboratoires Bangs Inc
Rack de séparation magnétique	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	S1506S
Tubes microfuges	Sarstedt	72,69
Incubateur de culture cellulaire	Eppendorf Scientific	M13520000
Nettoyeur à ultrasons Branson	Branson	n/a