1. Transfecter l’ARNm aux cellules
- Ensemencez les cellules HeLa dans une plaque à 24 puits (pour être environ ~80-90 % confluent le lendemain) et incubez pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Infectez les cellules HeLa avec le virus de la vaccine (VACV) à une multiplicité d’infection (MOI) de 5 ou conservez les cellules HeLa non infectées à des fins de comparaison.
note: Le MOI est le nombre de particules virales infectieuses par cellule.
- MOI de X = {[(Nombre de cellules * X) / titre de virus] * 1000} μl de virus par milieu de 1 mL.
- Après l’après-infection (hpi) souhaitée (dans cette expérience à 10-12 hpi), transfectez l’ARNm (500 ng d’ARNm total par puits de plaques à 24 puits) à l’aide d’un réactif de transfection lipidique cationique comme le montre la figure 1C.
- Pour un puits d’une plaque de 24 puits, mélangez 480 ng d’ARNm de la séquence 12A portant la luciférase de luciférase (12A-Fluc) et 20 ng d’ARNm de la séquence de Kozak portant la Renilla luciferase (Kozak-Rluc) dans un tube de microcentrifugation. Dans un autre tube de microcentrifugation, ajoutez 1,1 μL de réactif de transfection lipidique cationique.
- Ajouter 55 μL de milieu sérique réduit dans les deux tubes. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Après 5 min d’incubation, ajouter 55 μL de réactif de transfection lipidique cationique contenant un milieu sérique réduit dans un tube contenant de l’ARNm.
- Mélangez doucement mais soigneusement et laissez incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Pendant l’incubation, retirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 400 μL de milieu sérique réduit par puits de plaques de 24 puits.
- Après l’incubation, ajouter 100 μL du mélange goutte à goutte et uniformément dans un puits de plaques de 24 puits.
2. Mesurer les activités de la luciférase
- Cinq heures après la co-transfection de l’ARNm 12A-Fluc et Kozak-Rluc, mesurer l’activité de la luciférase à l’aide d’un système de dosage de la luciférase capable d’effectuer deux tests rapporteurs (p. ex., trousse de dosage Dual-Luciferase Reporter).
- Retirez le milieu sérique réduit et lysez les cellules en ajoutant 150 μL de tampon de lyse 1x, un composant du kit de dosage de la luciférase.
- Après 10 min d’incubation à température ambiante, récupérez le lysat en mettant les cellules au rebut et transférez-les dans un tube de microcentrifugation.
- Centrifuger le lysat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires.
- Ajouter 30 μL de surnageant dans une plaque d’essai blanche à 96 puits à paroi opaque et à fond solide.
- Mesurez la double luminescence à l’aide du kit de dosage de la luciférase et d’un luminomètre à lecteur de plaque multimode.
- Effectuez la mesure à l’aide de la fonction cinétique (par puits) à l’aide des paramètres décrits dans le Tableau 1.
note: La lecture peut également être effectuée à l’aide d’un luminomètre manuel. Ajouter un volume égal de lysat et de substrat pour Fluc dans une cuvette. Attendez 2 s et mesurez 10 s à l’aide d’un luminomètre. Après la mesure Fluc, retirez rapidement la cuvette du luminomètre et ajoutez manuellement un volume égal de substrat pour Rluc. Encore une fois, attendez 2 s et mesurez pendant 10 secondes à l’aide d’un luminomètre.
- Exportez les données de lecture de luminescence dans un format de fichier de votre choix.
- Déterminez le taux de traduction relatif de l’ARNm 12A-Fluc dans les cellules HeLa non infectées et infectées par VACV en divisant la valeur Fluc par la valeur Rluc de contrôle interne.
REMARQUE : La figure 2 montre l’analyse étape par étape des données brutes pour obtenir l’activité relative de Fluc.
Tableau 1 : Paramètres de mesure de la luciférase - les étapes de mesure de la luciférase avec le volume ou le temps recommandé.
| escalier | Volume/Temps |
| Injecter le substrat de dosage de la luciférase (Fluc) : | 30 μL |
| Attente / Temps d’incubation : | 2 s |
| Mesure de la luminescence (Fluc) : | 10 secondes |
| Substrat Stop & Glo (Rluc) : | 30 μL |
| Attente / Temps d’incubation : | 2 s |
| Mesure de la luminescence (Rluc) : | 10 secondes |
