Méthode de microtitration sur plaque pour évaluer la concentration minimale inhibitrice d’un antibiotique

Résumé

Source : Ketelboeter, L. M., et al. Méthodes pour inhiber la production de pyomélanine bactérienne et déterminer l’augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente une méthode basée sur une plaque de microtitration pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) des antibiotiques testés contre les bactéries. Lors de l’ajout d’une suspension de l’agent pathogène bactérien Pseudomonas aeruginosa à une plaque de microtitration contenant des dilutions en série d’un antibiotique testé et un inhibiteur de la production de pyomélanine par la bactérie, la densité optique des puits est mesurée pour calculer la concentration inhibitrice minimale de l’antibiotique, et l’impact de la production de pyomélanine inhibiteur sur la sensibilité aux antibiotiques de la bactérie.

Protocole

1. Dosage de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’antibiotiques dans des plaques à 96 puits

1. Mettre en place des cultures nocturnes des souches à tester dans LB (Luria-Bertani) avec et sans NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione).
   note: Ce protocole est décrit à l’aide du niveau représentatif de 300 μM NTBC.
   1. Ajouter 300 μM de NTBC à 2 ml de LB. Ajouter un volume équivalent de véhicule (diméthylsulfoxyde de méthyle, DMSO) à 2 ml de LB pour l’absence de NTBC.
   2. À l’aide de cure-dents stériles, inoculez des tubes avec une colonie isolée de bactéries. Il y aura une culture avec NTBC et une culture sans NTBC pour chaque souche. Incuber toute la nuit à 37 °C avec aération à l’aide d’un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air.
2. Le lendemain, réalisez les solutions maîtresses LB + NTBC et LB + DMSO pour la mise en place du test MIC. Ajouter le NTBC à une concentration de 600 μM, car il sera dilué deux fois lors de l’ajout d’inoculum, ce qui donne une concentration finale de 300 μM.
   1. Pour tester un antibiotique pour une souche, ajoutez 600 μM de NTBC à 2 ml de LB et mélangez pour obtenir la solution maîtresse de NTBC. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml LB et mélanger pour obtenir la solution maîtresse sans NTBC. Utilisez ces solutions pour créer des solutions mères d’antibiotiques ainsi que pour mettre en place la série de dilution dans des plaques à 96 puits.
      note: Les formulations de la solution maîtresse produiront des solutions supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage. Les solutions maîtresses peuvent être augmentées ou réduites selon les besoins en fonction du nombre d’antibiotiques et de souches testées.
3. Préparez les solutions antibiotiques dans les solutions maîtresses LB + NTBC ou LB + DMSO.
   note: La concentration d’antibiotiques dans ces solutions doit être le double de la concentration finale souhaitée. Il faut faire suffisamment de solution pour transférer 100 μl dans quatre puits dans une plaque de 96 puits.
   1. Préparer une solution mère de gentamicine +/- NTBC à 64 μg/ml. Pour préparer cette solution, ajoutez 0,288 μl de stock de gentamicine (100 mg/ml) à 450 μl LB + NTBC ou LB + DMSO solution maîtree.
      REMARQUE : La concentration maximale de gentamicine pour Pseudomonas aeruginosa PAO1 est de 32 μg/ml.
   2. Préparez la solution mère de kanamycine +/- NTBC à 256 μg/ml. Pour préparer cette solution, ajoutez 3,84 μl de stock de kanamycine (30 mg/ml) à 450 μl de solutions mères LB + NTBC ou LB + DMSO.
      note: La concentration maximale de kanamycine pour P. aeruginosa PAO1 est de 128 μg/ml.
   3. Préparer une solution mère de tobramycine +/- NTBC à 8 μg/ml. Pour préparer cette solution, ajoutez 0,36 μl de stock de tobramycine (10 mg/ml) à 450 μl de solutions maîtresses LB + NTBC ou LB + DMSO.
      note: Pour P. aeruginosa PAO1, la concentration maximale de tobramycine est de 4 μg/ml.
      note: Les antibiotiques et les concentrations peuvent être ajustés en fonction des bactéries à tester.
4. Ajouter 100 μl de chaque solution d’antibiotique 2x dans quatre puits dans une plaque de 96 puits. Placez ces solutions dans la rangée A. Par exemple, la gentamicine doit être placée dans A1 à A4, la kanamycine dans A5 à A8 et la tobramycine dans A9 à A12. Voir la figure 1A pour un schéma d’une configuration de plaque à 96 puits.
   note: Plusieurs antibiotiques peuvent être testés dans une seule plaque, mais une seule souche doit être testée par boîte pour éliminer le risque de contamination croisée par d’autres souches.
5. Ajouter 50 μl de la solution maîtresse LB + NTBC ou LB + DMSO aux rangées B à H de la plaque à 96 puits. Assurez-vous qu’une plaque est LB + NTBC et qu’une plaque est LB + DMSO. Voir la figure 1A.
   1. Utilisez LB + NTBC pour les antibiotiques dans LB + NTBC. Utilisez LB + DMSO pour les antibiotiques dans LB + DMSO.
6. À l’aide d’une micropipette, effectuez des dilutions en deux fois en série des antibiotiques en transférant 50 μl de la solution de la rangée A à la rangée B. Mélangez la solution, changez les pointes de la pipette et transférez 50 μl de la solution de la rangée B à la rangée C. Répétez l’opération pour les rangées restantes. Après avoir dilué la rangée G, retirez 50 μl de la solution de cette rangée et jetez-la. Utilisez la rangée H comme contrôle sans antibiotique pour la croissance bactérienne. Voir Figure 1B.
   REMARQUE : Chaque puits des rangées A à G contient maintenant 50 μl d’antibiotique dans LB + NTBC ou LB + DMSO à 2 fois la concentration finale souhaitée. La rangée H contient LB + NTBC ou LB + DMSO sans antibiotiques.
7. Mesurez la DO₆₀₀ des cultures de nuit. Laver toutes les cultures avant de prendre des lectures OD₆₀₀ pour éliminer la pyomélanine présente dans le milieu.
   1. Laver les cultures en centrifugeant 1 ml de culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 x g pendant 2 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 ml de lb.
8. Diluer les cultures de nuit à 2,75 x 10⁵ UFC/ml en LB.
   note: Supposons qu’une unité de DO₆₀₀ équivaut à 1 x 10⁹ UFC/ml pour P. aeruginosa. Les conversions de la DO en UFC/ml peuvent être différentes chez d’autres bactéries.
9. Ajouter 50 μl de la culture bactérienne diluée dans le puits approprié.
   note: Les cultures cultivées dans le NTBC devraient être ajoutées aux puits contenant du NTBC et les cultures cultivées dans le DMSO devraient être ajoutées aux puits contenant du DMSO. Voir la figure 1B.
   1. Ajoutez des bactéries dans trois puits pour chaque souche et concentration d’antibiotiques. Ajouter 50 μl de LB dans le quatrième puits pour agir comme contrôle de la contamination bactérienne. Voir la figure 1B.
   2. Utilisez une micro-pipette multicanaux pour inoculer les puits. Assurez-vous que les pointes des pipettes sont près du fond des puits lors de l’ajout d’inoculum afin d’éviter la contamination des puits voisins.
      note: L’ajout de cultures bactériennes dans les puits diluera deux fois les concentrations d’antibiotiques et de NTBC.
10. Recouvrez les plaques à 96 puits de parafilm et incubez pendant environ 24 heures à 37 °C. Incuber les plaques à 96 puits de manière statique, dans un incubateur à air.
11. Examinez les plaques pour détecter la croissance bactérienne dans les puits. La CMI est la concentration la plus faible d’antibiotique dans laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée pour les trois réplicats de chaque souche.
    1. Examinez visuellement la plaque pour vérifier qu’elle ne pousse pas ou lisez-la à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur OD₆₀₀.

Résultats

Figure 1 : Schéma de la configuration d’une plaque à 96 puits pour le dosage d’une CMI antibiotique. (A) 100 μl de 2 antibiotiques de la concentration de départ la plus élevée se trouvent dans la rangée A. Les rangées B à H sont remplies de 50 μl de LB + NTBC ou de LB + DMSO sans antibiotiques. (B) Des dilutions en série en deux sont effectuée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269 à 50 mg	Aussi appelé nitisinone. Soluble dans le DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	Référence 216763-100ML	30 % en poids en H2O. Stabilisé.
gentamicine	Biographie d’or	G-400-100	Soluble dans H2O. Filtrer stériliser.
kanamycine	Fisher Scientific	Réf. BP906-5	Soluble dans H2O. Filtrer stériliser.
Tobramycine	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble dans H2O. Filtrer stériliser.