1. Fabrication d’hydrogels minces en polyacrylamide (PA) à deux couches sur des plaques multipuits
- Fabrication d’hydrogel de polyacrylamide
note: Voir la figure 1.
- Préparez des solutions aqueuses contenant de 3 à 10 % de solution mère d’acrylamide à 40 % (voir le tableau des matériaux) et de 0,06 à 0,6 % de la solution mère de bis-acrylamide à 2 % (voir le tableau des matériaux) pour fabriquer des hydrogels d’une rigidité réglable allant de 0,6 kPa à 70 kPa. Voir le tableau 1.
- Pour les hydrogels de 0,6 kPa, mélangez 3 % d’acrylamide avec 0,045 % de bis-acrylamide. Pour des hydrogels de 3 kPa, mélangez 5 % d’acrylamide avec 0,074 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 10 kPa, mélangez 10 % d’acrylamide avec 0,075 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 20 kPa, mélangez 8 % d’acrylamide avec 0,195 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 70 kPa, mélanger 10 % d’acrylamide avec 0,45 % de bis-acrylamide.
REMARQUE : De plus amples détails sur l’obtention de la rigidité souhaitable de l’hydrogel PA peuvent être trouvés ailleurs.
- Préparez deux solutions aqueuses pour chaque rigidité d’hydrogel souhaitée. Préparez la solution 1 pour qu’elle soit exempte de billes et la solution 2 pour qu’elle contienne 0,03 % de microbilles fluorescentes de 0,1 μm de diamètre (voir le tableau des matériaux).
- Dégazer les solutions 1 et 2 sous vide pendant 15 min pour éliminer l’oxygène connu pour inhiber la polymérisation des solutions.
- Ajouter 0,6 % de la solution mère de 10 g/mL d’APS et 0,43 % de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution 1 pour permettre l’amorce de la polymérisation. Agissez vite.
- Ajouter 3,6 μL de la solution 1 au centre de chaque puits de la boîte à 24 biens.
- Couvrez immédiatement les puits avec des lamelles circulaires non traitées de 12 mm et laissez reposer la solution 1 pendant 20 minutes afin qu’elle polymérise complètement.
- Tapotez doucement l’aiguille d’une seringue sur une surface pour créer un petit crochet à son extrémité afin de faciliter le retrait des lamelles. Soulevez les lamelles à l’aide de l’aiguille de la seringue.
- Ajouter 0,6 % de la solution mère APS de 10 g/mL et 0,43 % de TEMED à la solution 2. Déposez 2,4 μL du mélange sur la première couche dans chaque puits du plat à 24 puits.
- Couvrez la solution 2 avec des lamelles en verre circulaires de 12 mm, en appuyant doucement vers le bas à l’aide d’une paire de pinces pour garantir que l’épaisseur de la deuxième couche est minimale. Laisser la solution 2 polymériser pendant 20 min.
- Ajoutez 500 μL de 50 mM de HEPES pH 7,5 dans chacun des puits, puis retirez les lamelles en verre à l’aide de l’aiguille de la seringue et de la pince.
- Stérilisation, enrobage de collagène et équilibrage d’hydrogels de polyacrylamide
- Exposez les hydrogels aux UV pendant 1 h dans le capot de culture tissulaire pour permettre la stérilisation.
- Préparez un mélange de 0,5 % en poids/volume de sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophénylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH, voir le tableau des matériaux) dans 1 % de DMSO et 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Ajoutez 200 μL de cette solution sur la surface supérieure des hydrogels. En agissant rapidement, exposez-les aux UV (302 nm) pendant 10 min pour les activer.
- Lavez les hydrogels deux fois avec 1 mL de 50 mM HEPES pH = 7,5. Répétez l’opération si nécessaire pour vous assurer que tout excès de réticulant est retiré.
- Enrobez les hydrogels de protéines avec 200 μL de 0,25 mg/mL de collagène I de queue de rat (voir le tableau des matériaux) dans 50 mM de HEPES. Incuber les hydrogels, avec la solution de collagène sur le dessus, pendant la nuit à température ambiante.
note: Pour prévenir la déshydratation ou l’évaporation, placez les plaques multipuits dans un confinement secondaire et ajoutez des mouchoirs de nettoyage de laboratoire imbibés d’eau à la périphérie intérieure de l’enceinte de confinement.
- Utilisez un microscope à épifluorescence ou confocal avec un objectif 40X pour mesurer l’épaisseur des hydrogels. Pour ce faire, placez les positions z du bas (là où se trouve la surface du verre) et des plans supérieurs de l'hydrogel (où l'intensité des billes fluorescentes est maximale). Soustrayez ensuite les positions z pour déterminer la height.
note: Nous avons utilisé un microscope à épifluorescence inversée et un objectif 40X avec une ouverture numérique de 0,65 pour mesurer l’épaisseur des hydrogels. Des mesures de microscopie à force atomique (AFM) peuvent également être effectuées à ce stade pour confirmer la rigidité exacte des hydrogels (voir Figure 2).
- Avant d’ensemencer les cellules d’intérêt sur les hydrogels, ajoutez 1 mL de milieu sur les hydrogels et incubez-les à 37 °C pendant 30 min à 1 h pour assurer l’équilibre.
note: Nous avons ajouté le milieu complet MCDB-131 car il s’agit du milieu dans lequel les cellules hôtes du modèle (HMEC-1) ont été cultivées (voir l’étape 2.1 pour plus de détails).
2. Culture de cellules endothéliales microvasculaires humaines et ensemencement sur hydrogels
- Cultiver des cellules HMEC-1 (endothéliales microvasculaires humaines) dans des milieux MCDB-131 complets contenant des milieux MCDB-131 complétés par 10 % de sérum fœtal bovin, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 1 μg/mL d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine (voir le tableau des matières).
- Divisez les cultures confluentes au 1:6 tous les 3 à 4 jours et conservez les cellules jusqu’au passage 40.
- Un jour avant l’expérience, détachez les cellules de leur récipient de culture en utilisant 0,25 % de trypsine/EDTA. Lavez d’abord les cellules et leur récipient de culture 1 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), puis ajoutez la quantité appropriée de trypsine/EDTA à 0,25 % (2 ml par boîte de 100 mm ou fiole de 75 cm, 1 ml par boîte de 60 mm ou fiole de 25 cm), en incubant la fiole à 37 °C pendant 5 à 10 minutes pour permettre aux cellules de se détacher de leur substrat.
- Neutralisez la trypsine en ajoutant le volume souhaité de milieu complet MCDB-131, pipetez doucement pour briser les amas de cellules, puis placez la solution dans un tube de centrifugation conique.
- Agitez doucement la solution de cellules pour vous assurer qu’elles sont uniformément réparties, puis retirez 20 μL de la solution et remplissez très doucement les deux chambres sous la lamelle d’un hémocytomètre en verre.
- Granuler la solution des cellules contenues dans le tube de centrifugation conique par centrifugation pendant 10 min à 500 x g.
- Pendant la période d’attente de 10 minutes, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. À l’aide d’un microscope, faites la mise au point sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre avec un objectif 10X, puis utilisez un compteur de pointage manuel pour compter le nombre de cellules dans un carré de 1 mm x 1 mm.
- Déplacez l’hémocytomètre vers un autre carré de 1 mm x 1 mm, comptez les cellules à cet endroit, puis répétez le processus deux fois de plus. Calculez la moyenne des quatre mesures, puis multipliez la moyenne par 104. La valeur finale est le nombre de cellules viables/mL dans la suspension cellulaire en cours de centrifugation.
- Retirez le liquide du tube de centrifugation conique tout en veillant à ce que la pastille de la cellule ne soit pas perturbée. Remettre en suspension les cellules dans le milieu complet MCDB-131 à une concentration de 4 x 105 cellules/mL.
- Ensemencez les cellules en suspension sur les hydrogels en retirant d’abord le milieu avec lequel les hydrogels ont été incubés, puis en ajoutant 1 mL de suspension cellulaire sur chaque hydrogel.
3. Infection des cellules endothéliales microvasculaires humaines par L. monocytogenes
- Trois jours avant l’infection, prélever la souche Lm à utiliser à partir d’un stock de glycérol (stocké à -80 °C) sur une plaque de gélose BHI contenant 7,5 μg/mL de chloramphénicol et 200 μg/mL de streptomycine, le cas échéant.
note: La souche à strier peut être de type sauvage ou mutant, exprimant constitutivement la fluorescence (pour l’immunomarquage JAT1045 a été utilisé) ou exprimant la fluorescence sous le promoteur ActA (pour la cytométrie en flux ou la microscopie à force de traction, JAT983 ou JAT985 ont été utilisés).
- Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à formation de colonies discrètes (1 à 2 jours).
- La veille de l’infection, cultivez la souche souhaitée pendant la nuit, en l’agitant à 150 tr/min à 30 °C dans un milieu BHI avec 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant).
- Placez 5 mL de milieu BHI dans un tube à centrifuger conique de 15 mL, ajoutez 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant), puis inoculez une seule colonie à partir de la plaque de gélose à l’aide d’un embout stérile de 10 μL.
- Le lendemain, juste avant l’infection, mesurer la densité optique de la solution bactérienne à 600 nm (OD600) en diluant l’échantillon 1:5 ; utiliser une cuvette contenant uniquement du BHI pour servir de blanc.
- Diluer la culture de nuit à une DO 600 de 0,1 et l’incuber, en agitant pendant 2 h à 30 °C, dans un milieu BHI avec 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant) pour permettre aux bactéries d’atteindre la croissance en phase logarithmique.
- Mesurez la DO 600 de la solution bactérienne, qui devrait être d’environ 0,2 à 0,3. Si l’OD600 est supérieur, diluez-le à 0,2 - 0,3 avec BHI seul.
- Prendre 1 mL de solution bactérienne dans un tube de microcentrifugation. Faites-le tourner pendant 4 min à 2 000 x g en utilisant la centrifugation à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 1 mL de PBS de qualité culture tissulaire, dans le capot de culture tissulaire. Lavez les bactéries deux fois de plus en les faisant tourner pendant 4 minutes à 2 000 x g à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre les bactéries en suspension dans 1 mL de PBS.
- Préparez le mélange infectieux en mélangeant 10 ou 50 μL de bactéries remises en suspension dans du PBS avec 1 mL de milieu complet MCDB-131 pour une multiplicité d’infections (MOI ; c’est-à-dire le nombre de bactéries par cellule hôte) d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par cellule hôte.
- Retirez le média des puits des plaques à 24 puits, en prenant soin de ne pas perturber les hydrogels ou les cellules. Lavez les cellules 1 fois avec 1 ml de milieu complet MCDB-131, puis ajoutez 1 ml de bactéries dans chaque puits.
- Couvrez l’assiette avec son couvercle et enveloppez-la d’un film alimentaire en polyéthylène pour éviter les fuites. Placez les plaques dans la centrifugeuse et faites tourner les échantillons pendant 10 min à 200 x g pour synchroniser l’invasion. Déplacez les plaques dans l’incubateur de culture tissulaire et incubez-les pendant 30 min à 37 °C.
- Lavez les échantillons 4 fois avec le milieu complet MCDB-131 et déplacez-les dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 30 minutes supplémentaires, remplacer le milieu par un milieu complété par 20 μg/mL de gentamicine.
4. Cytométrie en flux pour quantifier la susceptibilité dépendante de la rigidité de la matrice extracellulaire des cellules hôtes à l’infection
- Pesez 5 mg de collagénase et placez-le dans un tube à centrifuger conique de 15 ml. Ajouter 10 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % et bien mélanger.
- 8 h après l’infection, retirez le milieu des puits de la plaque à 24 puits et lavez les puits 1x avec une culture tissulaire PBS. Retirez le PBS des puits et ajoutez 200 μL du mélange trypsine-EDTA/collagénase dans chaque puits. Placez-le dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes pour permettre le détachement complet des cellules.
- Utilisez une pipette neuve pour chaque puits et pipetez le mélange de haut en bas 8 fois. Soyez doux pour ne pas endommager les cellules. Ajouter 200 μL de milieu complet dans chaque puits pour neutraliser la trypsine.
- Transvaser la solution cellulaire de 400 μL de chaque puits dans un tube de polystyrène de 5 mL muni d’un capuchon de crépine de 35 μm (voir le Tableau des matériaux).
- Analysez 10 000 à 20 000 cellules par échantillon par cytométrie en flux. Effectuer l’acquisition de données par cytométrie en flux et déterminer le pourcentage de cellules infectées par puits à l’aide d’un logiciel pertinent disponible dans le commerce. Utilisez les diagrammes de dispersion directe et latérale pour bloquer la majeure partie de la distribution du nombre de cellules.
REMARQUE : Cela garantira l’analyse des cellules simples et éliminera les débris ou les doublets ou triplés de cellules.
- Mesurez le signal de fluorescence des cellules témoins non infectées et repérez la population de cellules infectées à l’exclusion de l’autofluorescence.
Table 1. Composition des hydrogels de polyacrylamide (PA) de rigidité variable. Dans ce tableau, le pourcentage de solution mère d'acrylamide à 40 % et le pourcentage de solution mère de bis-acrylamide à 2 % pour obtenir une rigidité donnée (module de Young, E) sont indiqués dans différentes colonnes.
| Module de Young (E, kPa) | % d’acrylamide (à partir de 40 % de stock) | Bisacrylamide % (à partir de 2 % de stock) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
