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1. Fabrication d’hydrogels minces en polyacrylamide (PA) à deux couches sur des plaques multipuits
- Dissoudre le persulfate d’ammonium (APS) dans de l’eau ultrapure distillée pour atteindre une concentration finale de 10 g/mL. Aliquote et conserver la solution à 4 °C pour une utilisation à court terme (3 semaines).
REMARQUE : La solution ci-dessus peut être préparée avant la fabrication de l’hydrogel.
- Activation du verre des plats à 24 puits
- Incuber des plaques de fond en verre de 24 puits avec des puits de 13 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h avec 500 μL d’hydroxyde de sodium (NaOH) 2 M par puits à température ambiante.
- Rincez les puits 1 fois avec de l’eau ultrapure, puis ajoutez 500 μL de triéthoxysilane à 2 % (3-Aminopropyle) (voir le tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 95 % dans chaque puits pendant 5 min.
- Rincez à nouveau les puits 1 fois avec de l’eau et ajoutez 500 μL de glutaraldéhyde à 0,5 % dans chaque puits pendant 30 min. Rincez les puits 1 fois à l’eau et séchez-les à 60 °C sans le couvercle.
- Fabrication d’hydrogel de polyacrylamide
REMARQUE : Voir Figure 1.
- Préparez des solutions aqueuses contenant de 3 à 10 % de solution mère d’acrylamide à 40 % (voir le tableau des matériaux) et de 0,06 à 0,6 % de la solution mère de bis-acrylamide à 2 % (voir le tableau des matériaux) pour fabriquer des hydrogels d’une rigidité réglable allant de 0,6 kPa à 70 kPa. Voir le tableau 1.
- Pour les hydrogels de 0,6 kPa, mélangez 3 % d’acrylamide avec 0,045 % de bis-acrylamide. Pour des hydrogels de 3 kPa, mélangez 5 % d’acrylamide avec 0,074 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 10 kPa, mélangez 10 % d’acrylamide avec 0,075 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 20 kPa, mélangez 8 % d’acrylamide avec 0,195 % de bis-acrylamide. Pour les hydrogels de 70 kPa, mélangez 10 % d’acrylamide avec 0,45 % de bis-acrylamide.
REMARQUE : De plus amples détails sur l’obtention de la rigidité souhaitable de l’hydrogel PA peuvent être trouvés ailleurs.
- Préparez deux solutions aqueuses pour chaque rigidité d’hydrogel souhaitée. Préparez la solution 1 pour qu’elle soit exempte de billes et la solution 2 pour qu’elle contienne 0,03 % de microbilles fluorescentes de 0,1 μm de diamètre (voir le tableau des matériaux).
- Dégazer les solutions 1 et 2 sous vide pendant 15 min pour éliminer l’oxygène connu pour inhiber la polymérisation des solutions.
- Ajouter 0,6 % de la solution mère de 10 g/mL d’APS et 0,43 % de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution 1 pour permettre l’amorce de la polymérisation. Agissez vite.
- Ajouter 3,6 μL de solution 1 au centre de chaque puits de la boîte à 24 puits (voir l’étape 1.2 pour sa préparation).
- Couvrez immédiatement les puits avec des lamelles circulaires non traitées de 12 mm et laissez reposer la solution 1 pendant 20 minutes afin qu’elle polymérise complètement.
- Tapotez doucement l’aiguille d’une seringue sur une surface pour créer un petit crochet à son extrémité afin de faciliter le retrait des lamelles. Soulevez les lamelles à l’aide de l’aiguille de la seringue.
- Ajouter 0,6 % de la solution mère APS de 10 g/mL et 0,43 % de TEMED à la solution 2. Déposez 2,4 μL du mélange sur la première couche dans chaque puits du plat à 24 puits.
- Couvrez la solution 2 avec des lamelles en verre circulaires de 12 mm, en appuyant doucement vers le bas à l’aide d’une paire de pinces pour garantir que l’épaisseur de la deuxième couche est minimale. Laisser la solution 2 polymériser pendant 20 min.
- Ajouter 500 μL de 50 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique (HEPES) pH 7,5 dans chacun des puits, puis retirer les lamelles en verre à l’aide de l’aiguille de la seringue et de la pince.
- Stérilisation, enrobage de collagène et équilibrage d’hydrogels de polyacrylamide
- Exposez les hydrogels aux UV pendant 1 h dans le capot de culture tissulaire pour permettre la stérilisation.
- Préparez un mélange de 0,5 % en poids/volume de sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophénylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH, voir le tableau des matériaux) dans 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Ajoutez 200 μL de cette solution sur la surface supérieure des hydrogels. En agissant rapidement, exposez-les aux UV (302 nm) pendant 10 min pour les activer.
- Lavez les hydrogels deux fois avec 1 mL de 50 mM HEPES pH = 7,5. Répétez l’opération si nécessaire pour vous assurer que tout excès de réticulant est retiré.
- Enrobez les hydrogels de protéines avec 200 μL de 0,25 mg/mL de collagène I de queue de rat (voir le tableau des matériaux) dans 50 mM de HEPES. Incuber les hydrogels, avec la solution de collagène sur le dessus, pendant la nuit à température ambiante.
REMARQUE : Pour prévenir la déshydratation ou l’évaporation, placez les plaques multipuits dans un confinement secondaire et ajoutez des chiffons de nettoyage de laboratoire imbibés d’eau à la périphérie intérieure de l’enceinte de confinement.
- Utilisez un microscope à épifluorescence ou confocal avec un objectif 40X pour mesurer l’épaisseur des hydrogels. Pour ce faire, placez les positions z du bas (là où se trouve la surface du verre) et des plans supérieurs de l'hydrogel (où l'intensité des billes fluorescentes est maximale). Soustrayez ensuite les positions z pour déterminer la hauteur.
REMARQUE : Nous avons utilisé un microscope à épifluorescence inversée et un objectif 40X avec une ouverture numérique de 0,65 pour mesurer l’épaisseur des hydrogels. Des mesures de microscopie à force atomique (AFM) peuvent également être effectuées à ce stade pour confirmer la rigidité exacte des hydrogels (voir Figure 2).
- Avant d’ensemencer les cellules d’intérêt sur les hydrogels, ajoutez 1 mL de milieu sur les hydrogels et incubez-les à 37 °C pendant 30 min à 1 h pour assurer l’équilibre.
REMARQUE : Nous avons ajouté le milieu complet MCDB-131 car il s’agit du milieu dans lequel les cellules hôtes du modèle (HMEC-1) ont été cultivées (voir l’étape 2.1 pour plus de détails).
2. Culture de cellules endothéliales microvasculaires humaines et ensemencement sur hydrogels
- Cultiver des cellules HMEC-1 (endothéliales microvasculaires humaines) dans des milieux MCDB-131 complets contenant des milieux MCDB-131 complétés par 10 % de sérum fœtal bovin, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 1 μg/mL d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine (voir le tableau des matières).
- Divisez les cultures confluentes au 1:6 tous les 3-4 jours et conservez les cellules jusqu’au passage 40.
- Un jour avant l’expérience, détachez les cellules de leur récipient de culture en utilisant 0,25 % de trypsine/EDTA. Tout d’abord, lavez les cellules et leur récipient de culture 1 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis ajoutez la quantité appropriée de trypsine/EDTA à 0,25 % (2 ml par boîte de 100 mm ou fiole de 75 cm, 1 ml par boîte de 60 mm ou fiole de 25 cm), en incubant la fiole à 37 °C pendant 5 à 10 minutes pour permettre aux cellules de se détacher de leur substrat.
- Neutralisez la trypsine en ajoutant le volume souhaité de milieu complet MCDB-131, pipetez doucement pour briser les amas de cellules, puis placez la solution dans un tube de centrifugation conique.
- Agitez doucement la solution de cellules pour vous assurer qu’elles sont uniformément réparties, puis retirez 20 μL de la solution et remplissez très doucement les deux chambres sous la lamelle d’un hémocytomètre en verre.
- Granuler la solution des cellules contenues dans le tube de centrifugation conique par centrifugation pendant 10 min à 500 x g.
- Pendant la période d’attente de 10 minutes, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. À l’aide d’un microscope, faites la mise au point sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre avec un objectif 10X, puis utilisez un compteur de pointage manuel pour compter le nombre de cellules dans un carré de 1 mm x 1 mm.
- Déplacez l’hémocytomètre vers un autre carré de 1 mm x 1 mm, comptez les cellules à cet endroit, puis répétez le processus deux fois de plus. Calculez la moyenne des quatre mesures, puis multipliez la moyenne par 104. La valeur finale est le nombre de cellules viables/mL dans la suspension cellulaire en cours de centrifugation.
- Retirez le liquide du tube de centrifugation conique tout en veillant à ce que la pastille de la cellule ne soit pas perturbée. Remettre en suspension les cellules dans le milieu complet MCDB-131 à une concentration de 4 x 105 cellules/mL.
- Ensemencez les cellules en suspension sur les hydrogels en retirant d’abord le milieu avec lequel les hydrogels ont été incubés, puis en ajoutant 1 mL de suspension cellulaire sur chaque hydrogel.
3. Infection des cellules endothéliales microvasculaires humaines par Listeria monocytogenes (Lm)
- Préparation à l’avance
REMARQUE : Préparez les solutions suivantes à l’avance.
- Stocks de streptomycine, de chloramphénicol et de gentamicine
- Préparez 50 mg/mL de solutions mères de streptomycine en pesant 0,5 g de sulfate de streptomycine et en le dissolvant complètement dans 10 mL d’eau ultrapure.
- Préparez 7,5 mg/mL de solutions mères de chloramphénicol en pesant 75 mg de chloramphénicol et en le dissolvant complètement dans 10 mL d’éthanol à 100 %.
- Préparez 20 mg/mL de solutions mères de gentamicine en pesant 0,2 g de sulfate de gentamicine et en le dissolvant complètement dans 10 mL d’eau ultrapure.
- Stérilisez toutes les solutions mères à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm et conservez-les à -20 °C pour une utilisation à long terme (1 à 2 mois).
- Milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI) et plaques de gélose
- Localisez deux flacons de 1 L et ajoutez une barre d’agitation magnétique à l’intérieur de chaque flacon.
- Pour le milieu BHI, ajoutez 37 g de poudre BHI dans un flacon et ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à 1 L. Mélangez vigoureusement la solution en plaçant le ballon sur une plaque d’agitation magnétique jusqu’à ce que la poudre soit dissoute.
- Pour les plaques de gélose BHI, ajoutez 37 g de poudre de BHI et 15 g de gélose granulée (voir tableau des matériaux) dans la deuxième fiole et ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à 1 L. Mélangez vigoureusement la solution en plaçant la fiole sur une plaque d’agitation magnétique jusqu’à ce que la poudre soit dissoute.
- Vissez les couvercles des flacons sans trop serrer et autoclavez les solutions en utilisant le réglage liquide ou selon les spécifications de l'autoclave.
- Retirer la solution de l’autoclave, puis refroidir la solution d’agar-BHI à 55 °C. Si le milieu BHI contenu dans la fiole de 1 L est maintenu stérile, il peut être utilisé jusqu’à un mois.
- Pour préparer les plaques d’agar-BHI bactérien, ajoutez d’abord des antibiotiques, le cas échéant, dans la fiole contenant le BHI et la gélose (en fonction des souches bactériennes à cultiver). Placez brièvement le ballon sur une plaque d’agitation magnétique pour permettre un mélange rapide.
REMARQUE : Les antibiotiques utilisés ici sont spécifiques aux souches de Lm utilisées, mais tous les antibiotiques nécessaires peuvent être utilisés dans des plaques de gélose BHI. Nous avons ajouté la streptomycine à une concentration de 200 μg/mL et le chloramphénicol à une concentration de 7,5 μg/mL, car les souches de 10403S Lm sont résistantes à la streptomycine. Ces souches ont été conjuguées avec un plasmide qui contient le cadre de lecture ouvert de la chloramphénicol acétyltransférase, d’où la résistance au chloramphénicol.
- Verser le mélange dans des plaques de culture de bactéries en polystyrène de 10 cm (environ 20 ml par plaque). Pour vous débarrasser des bulles, flambez brièvement la surface supérieure des plaques. Refroidir les assiettes pendant la nuit à température ambiante.
- Le lendemain, fermez les plaques sèches et conservez-les à 4 °C.
- Infection des cellules endothéliales microvasculaires humaines par L. monocytogenes
- Trois jours avant l’infection, prélever la souche Lm à utiliser à partir d’un stock de glycérol (stocké à -80 °C) sur une plaque de gélose BHI contenant 7,5 μg/mL de chloramphénicol et 200 μg/mL de streptomycine, le cas échéant.
REMARQUE : La souche à strier peut être de type sauvage ou mutant, exprimant constitutivement la fluorescence (pour l’immunocoloration JAT1045 a été utilisée) ou exprimant la fluorescence sous le promoteur ActA (pour la cytométrie en flux ou la microscopie à force de traction, JAT983 ou JAT985 ont été utilisés).
- Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à formation de colonies discrètes (1 à 2 jours).
- La veille de l’infection, cultivez la souche souhaitée pendant la nuit, en l’agitant à 150 tr/min à 30 °C dans un milieu BHI avec 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant).
- Placez 5 mL de milieu BHI dans un tube à centrifuger conique de 15 mL, ajoutez 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant), puis inoculez une seule colonie à partir de la plaque de gélose à l’aide d’un embout stérile de 10 μL.
- Le lendemain, juste avant l’infection, mesurer la densité optique de la solution bactérienne à 600 nm (OD600) en diluant l’échantillon 1:5 ; utiliser une cuvette contenant uniquement du BHI pour servir de blanc.
- Diluer la culture de nuit à une DO 600 de 0,1 et l’incuber, en agitant pendant 2 h à 30 °C, dans un milieu BHI avec 7,5 μg/mL de chloramphénicol (le cas échéant) pour permettre aux bactéries d’atteindre la croissance en phase logarithmique.
- Mesurez la DO 600 de la solution bactérienne, qui devrait être d’environ 0,2-0,3. Si l’OD600 est supérieur, diluez-le à 0,2 - 0,3 avec BHI seul.
- Prendre 1 mL de solution bactérienne dans un tube de microcentrifugation. Faites-le tourner pendant 4 min à 2 000 x g en utilisant la centrifugation à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 1 mL de PBS de qualité culture tissulaire, dans le capot de culture tissulaire. Lavez les bactéries deux fois de plus en les faisant tourner pendant 4 minutes à 2 000 x g à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre les bactéries en suspension dans 1 mL de PBS.
- Préparez le mélange infectieux en mélangeant 10 ou 50 μL de bactéries remises en suspension dans du PBS avec 1 mL de milieu complet MCDB-131 pour une multiplicité d’infections (MOI ; c’est-à-dire le nombre de bactéries par cellule hôte) d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par cellule hôte.
- Retirez le média des puits des plaques à 24 puits, en prenant soin de ne pas perturber les hydrogels ou les cellules. Lavez les cellules 1 fois avec 1 ml de milieu complet MCDB-131, puis ajoutez 1 ml de bactéries dans chaque puits.
- Conservez un peu de mélange infectieux (au moins 100 μL) pour la détermination du MOI (voir étape 3.3).
- Couvrez l’assiette avec son couvercle et enveloppez-la d’un film alimentaire en polyéthylène pour éviter les fuites. Placez les plaques dans la centrifugeuse et faites tourner les échantillons pendant 10 min à 200 x g pour synchroniser l’invasion. Déplacez les plaques dans l’incubateur de culture tissulaire et incubez-les pendant 30 min à 37 °C.
- Lavez les échantillons 4 fois avec le milieu complet MCDB-131 et déplacez-les dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 30 minutes supplémentaires, remplacer le milieu par un milieu complété par 20 μg/mL de gentamicine.
- Détermination de la multiplicité de l’infection (MOI)
- Au cours de l’incubation initiale de 30 minutes des cellules hôtes avec la bactérie, préparez des dilutions en série de 10 fois du mélange infectieux pour déterminer le moment d’incubation. Effectuer des dilutions 10 fois en mélangeant 100 μL du mélange d’infection avec 900 μL de 1x PBS (dilution 10-1). Ensuite, mélangez 100 μL de la dilution 10-1 avec 900 μL de PBS (dilution 10-2).
- Continuer jusqu’à l’obtention d’une dilution de 10-5.
REMARQUE : Toutes les solutions doivent être bien mélangées avant de les diluer, et des pointes de pipette fraîches et propres doivent être utilisées à chaque étape.
- Une fois les dilutions effectuées, placez 100 μL des dilutions 10-2 - 10-5 au centre des plaques BHI/agar/chloramphénicol/streptomycine (le cas échéant).
- Fabriquez un écarteur à partir d’une pipette en verre en utilisant du feu pour plier la pipette afin de créer un crochet. Trempez la pipette dans de l’éthanol à 100 % pour la stérilisation, puis brûlez l’éthanol à la flamme.
- Une fois l’épandeur refroidi, répartissez les dilutions bactériennes de manière homogène sur les plaques en commençant par la dilution 10-5 et en passant aux mélanges plus concentrés. Incuber les assiettes à l’envers à 37 °C pendant 2 jours.
- Selon la densité de la colonie, déterminez le nombre de colonies des plaques de dilution 10-3 et 10-4 ou 10-4 et 10-5. Calculez le MOI comme suit :
nombre de colonies × facteur de dilution ÷ volume initialement ajouté = nombre d’unités formant colonies (UFC) par μL
nombre d’UFC par μL × volume de mélange de bactéries par puits = nombre d’UFC par puits
nombre d’UFC par puits × volume de cellules par puits = nombre de bactéries par cellule
REMARQUE : CFU signifie unités formant des colonies.
- Faites la moyenne des MOI de deux plaques pour obtenir les MOI finaux.
4. Microscopie quantitative time-lapse pour évaluer la rigidité de la matrice extracellulaire
Préparez les hydrogels de PA sur une plaque à 24 puits (voir étape 1), ensemencez des cellules HMEC-1 (voir étape 2) et cultivez des cultures JAT983 pendant la nuit comme décrit ci-dessus (voir étape 3).
- Le jour de l’infection, préparer le mélange infectieux en mélangeant 10 μL de pastilles bactériennes par mL de milieu complet MCDB-131. Retirer délicatement le milieu des puits des plaques à 24 puits et ajouter 1,9 mL du milieu complet MCDB-131 et 0,1 mL du mélange bactérien dans chaque puits.
REMARQUE : Le MOI inférieur utilisé dans cet essai est nécessaire pour analyser les événements de dissémination qui commencent par une seule bactérie envahissant une cellule hôte.
- Couvrez la plaque avec son couvercle et scellez-la avec une pellicule plastique pour éviter les fuites. Placez les plaques dans la centrifugeuse et faites tourner les échantillons pendant 10 min à 200 x g pour synchroniser l’invasion.
- Déplacez les plaques dans l’incubateur de culture tissulaire et incubez-les pendant 5 min.
- Lavez les échantillons 4 fois avec un milieu et déplacez-les dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 5 à 7 minutes supplémentaires, remplacer le milieu par un milieu complété par 20 μg/mL de gentamicine.
- Incuber la plaque dans l’incubateur pendant 5 heures supplémentaires pour permettre au promoteur actA de s’allumer et de stimuler l’expression du cadre de lecture ouvert mTagRFP.
- Préparez un milieu de microscopie en direct en complétant le L-15 de Leibovitz avec 10 % de sérum de veau fœtal, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique et 1 μg/mL d'hydrocortisone.
REMARQUE : Le L-15 contient déjà 2 mM de L-glutamine, il n’est donc pas nécessaire d’en ajouter supplémentaire comme dans le cas du média MCDB-131.
- Mélangez 1 μL de colorant Hoechst à 1 mg/mL avec 1 mL de milieu complet L-15 et ajoutez-le dans chaque puits pour colorer les noyaux des cellules. Placez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes, puis remplacez dans chaque puits le milieu complet L-15 par 1 mL de milieu complet L-15 complété par 20 μg/mL de gentamicine. Couvrez la plaque avec son couvercle et placez-la dans la chambre environnementale d'un microscope (voir Tableau des matériaux) équilibrée à 37 °C.
REMARQUE : Pour l’imagerie, un microscope à épifluorescence inversée a été utilisé avec une caméra CCD (voir le tableau des matériaux) et un objectif à fluorite à plan d’air 20X avec 0,75 NA. La puissance a été réglée à 50 % et le temps d’exposition à 50 ms. Les filtres de microscope utilisés pour mCherry sont respectivement de 470/525 nm pour l’excitation et l’émission.
- Imagez plusieurs positions toutes les 5 minutes à l’aide d’une fonction de mise au point automatique pour surveiller la propagation de Lm à travers les monocouches HMEC-1 ensemencées sur des hydrogels à rigidité variable.
REMARQUE : Le L-15 est tamponné avec HEPES, il n’est donc pas nécessaire d’utiliser du CO2 pendant l’imagerie.
Table 1. Composition des hydrogels de polyacrylamide (PA) de rigidité variable. Dans ce tableau, le pourcentage de solution mère d'acrylamide à 40 % et le pourcentage de solution mère de bis-acrylamide à 2 % pour obtenir une rigidité donnée (module de Young, E) sont indiqués dans différentes colonnes.
| Module de Young (E, kPa) | % d’acrylamide (à partir de 40 % de stock) | Bisacrylamide % (à partir de 2 % de stock) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
