Détermination de l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux à l’aide d’un test sur plaque

1. Quantification de l’infection virale

REMARQUE : Les titres de virus des cornées porcines doivent être évalués tous les jours pour analyser l’effet du traitement médicamenteux.

1. Pour quantifier le virus, ensemencez les cellules Vero à une densité de 5 x 10⁵ cellules par puits si vous utilisez une plaque à 6 puits comme cela a été fait dans cette expérience. Faites-le un jour avant l’infection. Incuber les cellules en boîte pendant la nuit pour s’assurer qu’elles sont confluentes pour la quantification du virus.
2. Aliquote 500 μL de milieu sans sérum dans plusieurs tubes de microcentrifugation. Insérez un coton-tige stérile trempé dans les tubes remplis de milieu sans sérum. Les cotons-tiges doivent être trempés et mouillés pendant au moins 5 minutes avant l’utilisation.
3. Sans perturber le milieu sous-jacent, transportez la plaque de cornée porcine infectée dans une enceinte de biosécurité. À l’aide des cotons-tiges humides, effectuez 3 tours dans le sens des aiguilles d’une montre et 3 tours dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à un diamètre de 5 mm du centre de la cornée porcine infectée sans appliquer de pression excessive.
4. Réinsérez le coton-tige dans le tube de microcentrifugation rempli de sérum et tournez-le 5 fois dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. L’embout métallique du coton-tige doit être coupé court de manière à ce qu’il s’insère entièrement dans un tube de microcentrifugation et que le couvercle puisse être fermé.
5. Placez le tube de microcentrifugation contenant l’embout de coton écouvillonné sur une machine à vortex et vortex à grande vitesse pendant 1 min.
6. Effectuez une quantification virale via un test de plaque sur ces échantillons.
   note: Cette étape de quantification doit être effectuée les jours 2, 4 et éventuellement 6 jours après l’infection.

2. Quantification du virus par dosage de la plaque

REMARQUE : Pour effectuer un test de plaque, cultivez et plaquez des cellules Vero dans une plaque à 6 puits et assurez-vous d’une confluence de 90 % des cellules avant le début du test. Utilisez une fiole confluente de 75 cm² remplie de ces alvéoles. Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.

1. Lavez la monocouche confluente de cellules Vero dans le ballon avec 10 mL de solution saline tampon de phosphate fraîche (PBS) après avoir aspiré le milieu de culture. Répétez l’étape de lavage une fois de plus avec du PBS après avoir aspiré la première série de solutions de lavage.
2. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % à la monocouche cellulaire. Incuber le ballon à 37 °C pendant 5 min. À l’œil nu, assurez-vous que les cellules sont détachées de la surface intérieure du ballon. Sinon, attendez encore 5 minutes avant d’examiner à nouveau le ballon. Lorsque les cellules semblent s’être détachées, ajouter 9 mL de milieu entier à la monocouche pour s’assurer que les cellules se délogent complètement de la surface du ballon.
3. Prélevez toutes les cellules du flacon ainsi que l’ensemble du milieu et placez-les dans un tube à centrifuger de 15 ml.
4. Pour chaque puits des plaques à 6 puits utilisées pour le dosage des plaques, utilisez 300 μL du tube à centrifuger. Remplissez chaque puits de la plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu entier. Laissez les plaques dans l’incubateur pendant la nuit pour leur permettre de se développer et de former une monocouche confluente dans chaque puits.
5. Afin d’effectuer un dosage sur plaque, une dilution en série d’échantillons doit être effectuée avant la quantification du virus.
6. Effectuez une dilution log101 fois du virus dans des tubes de micro-centrifugation à l’aide de milieux sans sérum jusqu’à ce qu’une dilution de ^10-8 soit atteinte. Lorsqu’à une dilution ^{de 10-3}, transférez 1 mL de la dilution dans la monocouche de cellules plaquées après avoir aspiré le milieu de croissance sur les cellules de la plaque à 6 puits, ce sera l’étape d’infection. Incuber la plaque infectée dans un incubateur à 37 °C pendant 2 h.
7. Aspirez le milieu infectieux existant, lavez-le doucement avec du PBS deux fois pour enrober les cellules et ajoutez 2 ml de milieu chargé de méthylcellulose par puits dans les 6 puits. Incuber pendant 72 h ou jusqu’à ce que la formation de plaques soit visible. Les plaques peuvent être identifiées par la formation de petits espaces entre les cellules de la monocouche cellulaire.
8. Ajoutez lentement 1 ml de méthanol dans le coin de chaque puits, en utilisant la paroi comme pointe de guidage. Incuber la plaque à 6 puits à température ambiante pendant 15 min. Aspirez lentement le contenu de chaque puits de la plaque sans perturber ou agiter la monocouche cellulaire.
9. Ajoutez 1 ml de solution de travail de cristal violet dans chaque puits de plaque à 6 puits, en vous assurant que toutes les cellules sont couvertes. Incuber la plaque à 6 puits dans l’obscurité pendant 30 min. Jetez la solution de violet cristallin en l’aspirant et séchez les puits sur une feuille de papier absorbant.
10. Comptez le nombre de plaques au puits de dilution le plus élevé pour quantifier la teneur totale en virus dans la solution de départ. Répétez le processus deux fois pour confirmer le titre viral.