Un test pour déterminer l’initiation d’un biofilm polymicrobien sur des cellules infectées par le virus

Résumé

Source : Plotkin, B. J. et al., Détermination de l’initiation du biofilm sur les cellules infectées par le virus par des bactéries et des champignons. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo illustre l’initiation de la formation de biofilms polymicrobiens sur des cellules infectées par des virus par des bactéries et des champignons. L’infection par le virus de l’herpès simplex empêche l’attachement bactérien aux cellules, empêchant la co-localisation bactérienne-fongique. En revanche, les cellules non infectées présentent une co-localisation bactérienne-fongique et l’initiation de la formation d’un biofilm.

Protocole

1. Contraintes et manipulation du HSV

REMARQUE : Les HSV-1 (KOS) gL86 et HSV-2 (KOS) 333gJ^- recombinants non étalés avec l’activité rapporteuse de la bêta-galactosidase sont utilisés pour le dos.

1. Utiliser le virus d'un seul lot et le conserver à -80 °C dans un rapport de 1:1 de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) et du lait écrémé jusqu'à utilisation. Avant l’entreposage du lot viral, déterminer la concentration virale à l’aide d’un test d’o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal).
2. Déterminer la viabilité du virus et la multiplicité de l’infection (MOI) par coloration X-Gal pour chaque essai expérimental à l’aide d’un test d’entrée de virus rapporteur, comme décrit précédemment (figure 1).
3. Diluer le virus (Opt-MEM) en MOI. Fixer les monocouches (paraformaldéhyde ; 0,5 ml/puits) avant la coloration. Placer les contrôles de viabilité virale dans une plaque de microtitration distincte en parallèle avec les plaques de test polymicrobien.

2. Gestion des cellules HeLa 299

1. Croissance à 37 °C, 5 % de CO₂ dans du DMEM avec 4,5 g/L de glucose, 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, de la gentamicine (50 μg/ml) et de la L-glutamine. Cellules de passage à 80 % de confluence avec la solution de trypsine (acide éthylènediaminetétraacétique, 0,53 M EDTA ; 0,05 % de trypsine ; 5 ml/flacon).

3. Manipulation de C. albicans

REMARQUE : C. albicans obtenu à partir d’une source de laboratoire clinique est stocké à -80 °C dans du lait écrémé Remmel 2x milieu.

1. Cultiver le bouillon congelé sur un milieu Sabouraud Dextrose (37 °C). Après 24 heures, la sous-culture de C. albicans est placée sur un milieu fongique (37 °C ; 48 h) pour l’utilisation.
2. Générer des formes de tube germinatif (GT) (choisir des colonies représentatives ; 3 ml FBS ; 3 h ; 37 °C ; absorbance₆₀₀ (Abs₆₀₀), 0,3). Après l'incubation, laver GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS ; 2x ; 4 000 x g). Ajouter le GT lavé à l’HBSS chaud (37 °C ; 0,32 Abs₆₀₀). Les formes GT doivent être 99 % des cellules observées, telles que déterminées par le nombre d’hémocytomètres.
3. Préparez des suspensions mères sous forme de levure (YF) en prélevant des colonies représentatives de champignons (HBSS, 3 ml ; 0,32 Abs₆₀₀). Comptez le nombre de formes de fièvre jaune/ml au microscope à l’aide d’un hémocytomètre. Les formes de fièvre jaune doivent être constituées à 99 % des cellules observées, déterminées par le nombre de cellules observées par hémocytomètre.
4. Fabrication d’un stock fongique de travail (250 μl de stock GT ou YF dans 25 ml HBSS ; 37 °C ; 10⁵ unité formant colonie, (UFC/ml)

4. Manipulation de S. aureus

1. Magasin S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C ; Lait écrémé Remmel 2x). Culture sur gélose au sang de mouton (5 %; 37 °C ; 24 h). Prélever les colonies représentatives et les transférer dans un milieu de sels de mannitol dans les 2 jours pour le stock (37 °C ; 18 h).
2. Fabriquer une suspension mère de S. aureus (3 ml HBSS ; 1,32 Abs_{600 ;}10⁸ UFC/ml)
   1. Réaliser une souche de travail de S. aureus (100 μl de la souche dans 25 ml de HBSS ; 10⁵ UFC/ml).

5. Candida et S. aureus Suspensions

1. Préparez une suspension mixte de C. albicans et de S. aureus (250 μl de stock YF ou GT et 100 μl de stock de S. aureus dans 25 ml de HBSS).

6. Dosage du biofilm polymicrobien

1. Semez des plaques de 96 puits avec 200 μl de 2 x 10 cellules⁵ HeLa/ml (niveau de confluence de 85 %). Plaques de roche (30 à 45 min ; 37 °C) avant l’incubation (37 °C ; 5 % de CO₂ incubateur ; 18 h). Laver les monocouches (1x ; Opt-MEM) puis semer avec HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 gJ^- dans 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 et 10). Incuber les plaques (3 h ; 37 °C ; 5 % CO₂). N’utilisez qu’une seule souche virale par jour.
2. Laver les monocouches infectées (1x ; solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Mg⁺² et Ca⁺² ; 100 μl). Remplacer le PBS par du HBSS chaud en laissant 25 μl dans chaque puits.
   1. Ajouter les suspensions de travail YF, GT et/ou S. aureus (100 μl ; rapport cible/cellule =5:1 ; n = 16) comme indiqué dans le tableau 1. Incuber les plaques (statique ; 30 min ; 37 °C ; 5 % CO₂).
3. Après l’incubation, aspirez une colonne à la fois en remplissant immédiatement de 300 μl de PBS avec Mg⁺² et Ca⁺². Répétez cette étape deux fois, puis ajoutez un tampon de lyse pour dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA ; stérilisé par filtre ; 200 μl d’une dilution de 1:50).
4. Triturer rapidement le lysat de cellules HeLa, puis placer 50 μl sur des sels de mannitol (MS) et/ou des milieux fongiques (F) (Figure 2). Étalez le lysat à l’aide d’une tige de verre pliée à un angle de 90°. Incuber les plaques (18 h à 37 °C). Comptez manuellement le nombre de colonies par plaque. Les témoins sont constitués de l’adhésion de S. aureus et/ou de C. albicans aux cellules HeLa non infectées par le HSV.

Table 1. Détermination générale de l’adhérence microbienne dans les interactions polymicrobiennes.GT = phénotype du tube germinatif de Candida albicans ; YF= phénotype de la levure C. albicans ; MSSA = Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline ; MS = sels de mannitol moyens ; F= Milieu fongique.

Résultats

Graphique 1. X-gal Staining Pictures of Dosage Dependent HSV-1 Infection in HeLa cells. Cellules HeLa infectées par HSV-1 à divers MOI et X-Gal colorés. (A) Cellules HeLa dans un puits de 96 plaques avec contrôle de cellules HeLa faussement infectées colorées au X-Gal ; Grossissement initial de 20x ; (B) cellules HeLa dans un puits de 96 plaques avec des cellu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C. albicans
BBL Sabouraud Dextrose	Bd	211584
Gélose fongique	Point Scientifique	Référence 7205A
S.aureus
Gélose au sel de mannitol	Produits biologiques Troy	Référence 7143B
Gélose au sang de mouton	Produits biologiques Troy	221239
Cellules Hela
1xDMEM (milieu Eagle modifié de Dubelcco, avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine, sans pyruvate de sodium	Corning	Référence 10-017-CM
Gentamicine 50mg/ml	sigma	1397	Concentration finale de 50μg/ml dans le DMEM complet
Trypsine EDTA (0,05 % de trypsine, 0,53 M d’EDTA)Solution 1X	Corning	Référence 25-052-CI
Sérum fœtal bovin	Produits biologiques d’Atlanta	Réf. S11150	Concentration finale de 10 % dans le DMEM complet
Autres milieux et réactifs
L’ONPG	Thermo Scientific	Référence 34055
Ultra pur X gal	Invitrogen	Référence 15520-018
1x HBSS (solution saline équilibrée de Hanks)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Point Scientifique	Référence 30042-500
Lyse RIPA	Technologies de la vie	Référence 89901
ravitaillement
Plaques à 96 puits	Scientifique à feuilles persistantes	Référence 222-8030-01F
Tubes de culture 100x13	Thomas Scientific	Référence 9187L61