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1. Solutions et médias
- Préparez 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), un bouillon de dextrose Sabouraud et une gélose au dextrose Sabouraud conformément au tableau 1.
2. Conditions de croissance de l’inoculum fongique
- Conservez toutes les souches fongiques sous forme de bouillons congelés dans du glycérol à 35 % à -80 °C, jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Effectuez les étapes suivantes avant chaque expérience.
- Pour les souches de Candida albicans :
- Décongeler un flacon bouillon et transférer 200 μL à 10 ml de bouillon de dextrose Sabouraud dans un tube stérile en polypropylène de 50 ml avec un capuchon et faire culture pendant une nuit à 30 °C avec agitation (200 tr/min). N’oubliez pas d’incliner le tube et de laisser le capuchon légèrement ouvert pour une meilleure aération de la culture.
- Pour les souches de Cryptococcus neoformans :
- Raclez la surface gelée d’un flacon de stock. Déposer les cellules sur des plaques de gélose au dextrose Sabouraud et incuber pendant 48 h à 30 °C. Après la croissance visible de colonies isolées, conservez les plaques au réfrigérateur (4 °C) scellées avec un film de paraffine jusqu’à 15 jours.
- Prélever une colonie isolée de taille moyenne dans la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une anse d’inoculation stérile et inoculer 10 mL de bouillon de dextrose Sabouraud dans un tube conique stérile de 50 mL. Incuber pendant environ 24 h à 30 °C sous agitation (200 tr/min).
- Ne pas dépasser les 24 h d’incubation. Pensez à incliner le tube et à laisser le capuchon légèrement ouvert pour une meilleure aération. Il est toujours bon de normaliser le stade de croissance des cellules avant chaque test, car il s’agit d’un facteur important affectant la résistance aux antimicrobiens.
note: Les deux champignons ont été cultivés à 30 °C pour une propagation rapide dans nos expériences, mais la température peut être modifiée pour refléter les objectifs de l’étude, par exemple le traitement clinique (37 °C). Plus important encore, ce temps d’incubation initial doit être établi à l’avance pour chaque isolat fongique et maintenu tout au long de tous les tests pour assurer la reproductibilité.
- Après la croissance fongique, collectez les cellules en centrifugeant les tubes coniques à 1 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et ajouter 10 mL de PBS.
- Remettez les cellules en suspension et centrifugez-les à nouveau à 1 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Répétez le lavage et la centrifugation PBS deux fois de plus. Après le troisième lavage, remettre les cellules en suspension dans 5 mL (selon la taille des granulés) de milieu 2X RPMI-1640.
- Préparez 1 mL d’une dilution 1:100 ou 1:1 000 dans un tube de microcentrifugation (selon la turbidité de la suspension cellulaire).
- Aliquote 10 μL de cette dilution, placez-la dans une chambre d’hémocytomètre et comptez au microscope le nombre total de cellules dans les quatre quadrants d’angle. Calculer la concentration à l’aide de la formule : (nombre total de cellules/4) x facteur de dilution x 104 (constante de dilution de la chambre).
- Envisager une viabilité de 100 % si le nombre de souches de viabilité et les conditions de croissance ont été systématiquement corrélés pour l’isolat étudié.
note: La normalisation et le contrôle de la qualité des comptages de viabilité peuvent être effectués par placage arrière conformément à la méthode de concentration minimale inhibitrice (CMI) antifongique du Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST) pour les levures.
- Si la corrélation croissance/viabilité n’a pas été établie pour l’isolat à l’étude, mesurez la viabilité fongique en comptant les cellules vivantes dans un hémocytomètre à l’aide de colorants qui colorent sélectivement les cellules mortes, tels que la phloxine B11, le bleu trypan ou le vert Janus. N’utilisez les cellules fongiques pour ce protocole que si la viabilité de la population à ce stade est de 90 % ou plus.
REMARQUE : Les colorants morts/vivants peuvent ne pas bien fonctionner avec le champignon de votre choix. Veuillez les tester avant utilisation. Par exemple, le colorant bleu trypan ne fonctionne pas bien avec C. neoformans.
- Après cela, préparez les suspensions cellulaires dans le milieu 2X RPMI-1640 (inoculum ajusté 2X dans le milieu RPMI-1640). Pour les plaques à 96 puits, considérez un volume de 5 ml pour chaque plaque.
- Pour toutes les souches de C. albicans, préparer une suspension de cellules mères de 4 x 103 cellules/mL. Cette concentration est 2 fois supérieure à la concentration cellulaire finale dans chaque puits (2 x 103 cellules/mL).
- Pour les souches de C. neoformans, préparer une culture mère de cellules 2 x 104 cellules/mL. Cette concentration est le double de la concentration cellulaire finale dans chaque puits (1 x 104 cellules/mL).
- Pour d’autres champignons, testez avec un antifongique connu quelle concentration sera idéale pour l’étude particulière par rapport au temps d’incubation. Tenez compte du métabolisme et du temps de duplication du champignon.
3. Peptides (agent inconnu)
- Stockez les peptides lyophilisés à -20 °C et dissolvez-les dans de l’eau désionisée avant chaque expérience. La durée maximale de stockage une fois dissous dans l’eau dépendra de la nature de chaque peptide.
- Préparer des aliquotes correspondant à deux fois à la concentration finale la plus élevée testée dans l’essai (2X). Idéalement, préparez un petit nombre d’aliquotes avec suffisamment de peptides pour une utilisation unique afin d’éviter les cycles de gel-dégel.
note: Le choix de la concentration doit être basé sur la littérature et les propriétés du peptide. Il est recommandé de commencer les dilutions en série avec environ 100 μM de peptide, puis de diminuer ou d’augmenter cette plage de concentration en fonction des résultats obtenus.
4. Antifongiques de référence (contrôles positifs)
- Pour ceux dilués dans l’eau : préparer une solution 2X de la concentration la plus élevée de l’analyse (voir Section 5 : Dosage antifongique pour les étapes de dilution).
- Pour les souches de C. albicans, préparer une solution de 128 μg/mL de fluconazole ou de 128 μg/mL de caspofungine. La concentration sur plaque pour les deux sera de 64 μg/mL.
- Pour les souches de C. neoformans, préparer une solution de 32 μg/mL d’amphotéricine B (solution soluble dans l’eau). La concentration sur plaque sera de 16 μg/mL.
REMARQUE : Normalement, l’amphotéricine B est diluée dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), car cet antifongique est peu soluble dans l’eau. Cependant, il existe des préparations d’amphotéricine B solubles dans l’eau disponibles dans le commerce.
- Pour les antifongiques dilués dans un solvant organique : préparer une solution mère 100X dans du DMSO, puis la diluer à 10X dans de l’eau pour l’utilisation.
note: Ainsi, dans le puits, la concentration finale de DMSO ne dépassera pas 1 %. Un puits où le champignon va se développer dans un milieu contenant 1 % de DMSO car le contrôle est nécessaire étant donné que certains champignons ne tolèrent pas bien cette concentration du solvant. N’oubliez pas que le DMSO est photosensible, alors couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium ou placez-la dans une chambre sombre pendant la durée de la période d’incubation.
5. Dosage antifongique
REMARQUE : Les essais antifongiques in vitro sont effectués sur la base du test de sensibilité à la microdilution en bouillon des lignes directrices M27-A3 du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) avec quelques modifications.
- Préparez une dilution en série en deux fois de chaque peptide et contrôlez l’antifongique dans des microplaques de polystyrène à 96 puits jusqu’à un volume final de 50 μL.
- À l’aide d’une pipette, ajouter 100 μL de l’antifongique/peptide à la concentration 2X de la concentration finale la plus élevée souhaitée dans les colonnes 1 à 3, dans la rangée A.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 μL d’eau stérile dans les autres puits, dans les rangées B à H.
- Prélever 50 μL des puits ayant la concentration la plus élevée (rangée A), transférer dans le puits suivant de la concentration suivante (rangée B) et homogénéiser.
- Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que le puits ait la concentration la plus faible et jetez 50 μL de ce puits (rangée H). Laisser aux colonnes 11 et 12 (rangées A, B, C) seulement de l’eau pour le contrôle à blanc ou le témoin négatif/croissance.
- Ajouter 50 μL de l’inoculum ajusté 2X dans le milieu RPMI-1640 dans chaque puits (colonnes 1 à 3 plus colonne 11 (négatif/témoin de croissance)) ; la concentration finale pour C. albicans sera de 2 x 103 cellules/mL, et la concentration finale pour les souches de C. neoformans sera de 104 cellules/mL.
- Préparez les témoins à blanc (50 μL d’eau + 50 μL de milieu 2X RPMI-1640 sans cellules) et les témoins négatifs/de croissance (50 μL d’eau + 50 μL d’inoculum ajusté 2X RPMI-1640 sans antifongique), et chargez-les dans la plaque du puits comme décrit ci-dessus.
- Répéter la procédure pour chaque composé à tester et pour le contrôle antifongique choisi (colonnes 4-10).
note: Les dilutions en série peuvent être effectuées verticalement comme dans l’expérience ci-dessous, ou horizontalement dans la plaque (c’est-à-dire si le nombre de dilutions du composé/extrait donné qui doit être testé est de huit ou plus).
- Si les composés, les médicaments de référence ou l’un de ses composants sont photosensibles, effectuez le test à lumière réduite, couvrez les plaques d’une feuille d’aluminium ou placez-les dans une chambre sombre pendant les incubations.
- Tenez compte des recommandations facultatives suivantes.
- Scellez la plaque avec une plaque de recouvrement transparente qui permet l’échange de gaz, car cela aide à réduire l’évaporation.
- Placez la plaque dans une chambre humide, cela aidera également à réduire l’évaporation.
- Incuber les plaques à 37 °C pendant 24 h ou 48 h pour toutes les souches de C. albicans, et pendant 48 h en secouant 200 tr/min pour C. neoformans. Le volume final plus faible (100 μL) garantit qu’il n’y a pas de débordement.
note: Aucune différence significative n’a été observée entre les lectures de CMI à 24 h et à 48 h pour les souches de C. albicans. Néanmoins, les lectures à 48 h sont plus faciles à visualiser.
- Observez tous les puits, à l’aide d’un microscope optique inversé, avant et après la période d’incubation pour vérifier les changements de morphologie ainsi que pour vérifier les signes de contamination.
note: Les lectures peuvent être faites visuellement et photographiées à la fin de l’expérience. Avant chaque lecture, homogénéiser légèrement la plaque. Les lectures peuvent également être effectuées en mesurant sa DO à 600 nm, si des amas cellulaires ou une filamentation ne sont pas observés.
- Effectuez les expériences au moins trois fois à des dates différentes.
Table 1. Préparation des milieux et des réactifs.
| Douleur moyenne | préparation |
| 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen – 500 mL | 10,4 g de RPMI-1640 (complété par de la L-glutamine et du rouge de phénol ; sans bicarbonate) |
| 330 mM d’acide sulfonique de propane 3-(N-morpholino) (MOPS) |
| Ajuster au pH 7,0 avec NaOH |
| Stérilisation par filtration (filtre 0,22 μM) |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | 137 mM de NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| Autoclave à 121°C pendant 15 minutes. |
| Bouillon de dextrose Sabouraud | 15 g de poudre dans 500 mL d’eau distillée. |
| Ajuster au pH 7,0 avec NaOH |
| Autoclave à 121°C pendant 15 minutes. |
| Gélose au dextrose Sabouraud | 32,5 g de poudre dans 500 mL d’eau distillée. |
| Ajuster au pH 7,0 avec NaOH |
| Autoclave à 121°C pendant 15 minutes. |