Un test d’utilisation de l’ATP pour déterminer la survie bactérienne sous traitement antibiotique

Résumé

Source : Wang, Liang-Chun, et al. Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques des agrégats de Neisseria gonorrhoeae à l’aide de tests commerciaux d’utilisation de l’ATP et de coloration vivante/morte. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le test simple de mesure de l’ATP à l’aide d’un réactif de lueur de luciférase. Ce test est utilisé pour quantifier la survie à Neisseria gonorrhoeae après un traitement par ceftriaxone.

Protocole

1. Quantification de la viabilité des agrégations GC

1. Prélever le GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillonnez le GC de la plaque et mettez-le en suspension dans un bouillon préchauffé (GCP, tableau 1) complété par des solutions de NaHCO₃ à 4,2 % et de Kellogg à 1 %. Utilisez la spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm (une DO 650 de 1 = ~1 x 10⁹ UFC/mL) pour déterminer la concentration de bactéries en suspension.
2. Ajustez la concentration de GC à ~1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Ajouter 99 μL de suspension GC ajustée dans les puits d’une plaque de 96 puits.
4. Incuber la plaque pendant 6 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour permettre aux bactéries de s’agréger.
5. Ajouter 1 μL de ceftriaxone diluée en série (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/mL) dans chaque puits. Laissez certains puits non traités pour servir de témoins.
6. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
7. Soniquer la suspension 3 fois dans chaque puits pendant 5 s à 144 W et 20 kHz.
8. Ajoutez 100 μL de réactif de préchauffage d’utilisation de l’ATP disponible dans le commerce dans chaque puits, pipetez de haut en bas 3 fois et incubez pendant 15 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
9. Transférez soigneusement 150 μL de mélange de chaque puits dans un nouveau puits dans une microplaque noire de 96 puits et évitez d’introduire des bulles.
10. Mesurez l’absorbance de chaque puits à 560 nm à l’aide du lecteur de plaques.
11. Calculer le taux de survie par le rapport entre les lectures obtenues après un traitement en série à la ceftriaxone et les lectures provenant de puits non traités.

2. Analyse microscopique à fluorescence des agrégats Direct/Mort d’agrégats GC

1. Prélever le GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillonnez le GC de la plaque et mettez-le en suspension dans un milieu GCP préchauffé et des suppléments Kellogg à 1 %.
2. Déterminer le nombre de bactéries par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm et ajuster la concentration de GC à ~1 x 10⁷ UFC/mL.
3. Ajouter 198 μL de suspension GC dans des chambres à 8 puits à fond de lamelle.
4. Incuber la chambre pendant 6 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour permettre la formation d’agrégations.
5. Ajouter 2 μL de ceftriaxone (100 μg/mL ou diverses dilutions) dans chaque puits dans chaque condition d’agrégation. Incuber pendant la durée souhaitée à 37 °C avec 5 % de CO₂.
6. Ajouter 0,6 μL de mélange de solution de coloration vivante/morte dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
7. Acquérez des images de la série Z à l’aide d’un microscope confocal (un microscope équivalent peut être utilisé).
8. Analysez les images à l’aide du logiciel ImageJ pour mesurer la taille des agrégats GC et le rapport d’intensité de fluorescence FIR de la coloration vivante/morte dans chaque agrégat.

Tableau 1 : Recette pour 1 L de milieu de croissance bactérienne GCP.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100x supplément Kellogg's
agar-agar	Biologique des États-Unis	A0930
Dosage du BacTiter	Promega	Référence G8232
Ceftriaxone	TCI	Réf. C2226
Difco GC à base moyenne	Bd	Référence 228950
Nitrate ferrique, non ahydraté	Sigma-Aldrich	Référence 254223-10G
glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
Coloration vivante/morte BacLight	Invitrogen	N° L7012
MS11 Souche de Neisseria gonorrhoeae			aimablement fourni par le Dr Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Sonicateur	Kontes		Équivalent à 9110001