Détermination du rôle des cellules de type neutrophile dans la sensibilité des cellules de lymphome à un médicament testé

Résumé

Source : Hirz, T., et al. Isolement et analyse des neutrophiles pour déterminer leur rôle dans la sensibilité des cellules de lymphome aux agents thérapeutiques. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente un test étudiant le rôle des cellules de type neutrophile dans la protection des cellules de lymphome contre la cytotoxicité des agents chimiothérapeutiques. Une co-culture 3D, composée de cellules de type lymphome et neutrophiles, est établie et exposée à la vincristine, un médicament de chimiothérapie. Le contact direct avec les cellules de type neutrophile induit une régulation positive des protéines anti-apoptotiques dans les cellules du lymphome, favorisant ainsi leur survie en présence de vincristine.

Protocole

1. Différenciation des cellules HL60 le long de la voie granulocytaire et leur coculture avec les cellules B du lymphome RL dans un modèle 3D

1. Différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) en cellules de type neutrophile
   1. Ajustez le nombre de cellules HL60 à 3 x 10⁵ cellules/ml, puis ajoutez 1 μM d’acide rétinoïque (AR) et 1,25 % de DMSO pour induire leur différenciation. Ensemencer chaque 3 x 10⁵ cellules HL60 par puits dans une plaque de 48 puits, puis incuber pendant 48 heures à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Plus tard, récupérez les cellules et centrifugez-les à 300 g pendant 5 min à RT. Remettez les cellules en suspension avec un milieu RPMI complet pour le comptage à l’aide du compteur de viabilité cellulaire.
   3. Diluer ensuite la suspension cellulaire dans un milieu RPMI complet pour ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10⁵ cellules/ml et induire à nouveau leur différenciation en ajoutant 1 μM d’acide rétinoïque (RA) et 1,25 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ensemencer chaque 3 x 10⁵ cellules HL60 par puits dans une plaque de 48 puits et incuber pendant 48 heures supplémentaires à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Analyse de la différenciation HL60 (différentiel HL60)
   1. Récupérez les cellules et centrifugez les tubes à 300 g pendant 5 min à RT. Remettez le granulé en suspension avec un milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) pour le comptage à l’aide du compteur de viabilité cellulaire.
   2. Analyser les changements dans l’expression des marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux. Placez chacune 3 x 10⁵ cellules HL60 indifférenciées (issues de la culture cellulaire) et 3 x 10⁵ cellulesde différentiel HL60 dans des tubes en plastique de 5 ml pour l’analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et centrifugez les tubes à 300 g pendant 5 min à RT.
   3. Remettre les granulés en suspension dans 50 μl de sérum de veau fœtal (SAB) tamponné au phosphate (PBS) (4 %). Marquer les cellules avec des CD11b anti-humains conjugués à AF700 ou des CD38 anti-humains conjugués à APC (5 μl/10⁶ cellules). Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 30 min à 4 ^oC.
   4. Laver avec 500 μl de PBS-FBS (4 %) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à RT. Remettre les granulés en suspension dans 200 μl de PBS-FBS (4 %).
   5. Analysez sur cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 1A et la configuration optique suivante : laser 488 nm : FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP) ; laser 633 nm : APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Pour tester les changements morphologiques dans HL60diff, immobiliser les cellules sur des lames de verre pour un examen microscopique.
      1. Pour ce faire, remettez en suspension chaque 3 x 10⁴ cellules HL60 indifférenciées (issues de la culture cellulaire) et 3 x 10⁴ HL60 diff dans un milieu RPMI complet de 150 μl. Assemblez les lames de verre, les cartes filtrantes et les chambres d’échantillonnage dans la centrifugeuse à cytospin, en vous assurant que la centrifugeuse est équilibrée.
      2. Placez chaque type de cellule dans la chambre d’échantillonnage et la cytocentrifugeuse à 1 500 tr/min pendant 10 min à RT. Retirez les lames, les cartes filtrantes et les chambres d’échantillonnage de la centrifugeuse. Démontez soigneusement, afin de ne pas endommager les cellules de la lame. Jetez les cartes filtrantes et les chambres d’échantillonnage.
      3. Teignez les cellules à l’aide du kit de coloration Giemsa et laissez sécher les lames pendant 1 heure. Examinez les cellules au microscope avec un grossissement de 100X.
3. Culture 3D (3D)
   note: Assurez-vous que les matériaux utilisés dans cette expérience sont froids et que l’expérience se déroule sur de la glace.
   1. Remettre en suspension chaque 5 x 10 cellules⁴ RL, seules ou mélangées avec dudifférentiel HL60 dans un rapport RL :HL60différentiel 1:10, avec une matrice de membrane basale de 300 μl à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml coupée avec des ciseaux stériles afin d’élargir l’ouverture à environ 2 à 3 mm. Évitez les bulles lors de cette étape.
   2. Semez chaque 300 μl de suspension cellulaire/puits dans une plaque à 24 puits. Évitez les bulles lors de cette étape. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO₂ puis ajouter 1 ml de milieu RPMI complet pour chaque puits et incuber pendant 7 jours à 37 °C avec 5 % de CO₂. Changez de milieu tous les deux jours. Ajouter 10 nM de vincristine au jour 5.
4. Analyse FACS
   1. Après 7 jours de culture, aspirez le milieu et lavez bien chacun avec 1 ml de PBS glacé deux fois. Ajouter 3 ml/puits d’acide PBS-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) glacé (5 mM). Détachez le gel du fond du puits en grattant à l’aide du bas de la pointe de la pipette de 200 μl. Agitez doucement l’assiette sur de la glace pendant 30 min.
   2. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 ml et agitez doucement les tubes sur de la glace pendant encore 30 min. Vérifiez l’apparence d’une suspension cellulaire homogène. (Si ce n'est pas le cas, secouez les cellules plus longtemps ou ajoutez plus de PBS-EDTA).
   3. Centrifugez les tubes à 300 x g pendant 10 min à RT. Lavez les granulés avec du PBS puis centrifugez à 300 x g pendant 10 min à RT.
   4. Remise en suspension avec PBS-FBS (4 %) et marquage avec un anticorps CD19 humain conjugué à PE-Cy7 et un anticorps CD38 humain conjugué à APC (5 μl/10⁶ cellules). Incuber à l’obscurité pendant 30 min à 4 ^oC.
   5. Laver avec 500 μl de PBS-FBS (4 %) puis des tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à RT. Remettre les cellules en suspension avec de l’Annexine V et du PI à l’aide d’un kit commercial.
   6. Analyse sur cytomètre en flux à l’aide de la stratégie de déclenchement de la figure 2A et de la configuration optique suivante : laser 488 nm : FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP) ; laser 633 nm : APC (660/20 BP). Assurez-vous de la compensation des couleurs.

Résultats

Figure 1. Paramètres structurels des cellules HL60 différenciées. (A) Les graphiques de diffusion vers l’avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) représentent les cellules HL60 et HL60 différenciées (HL60diff). (B) Les cellules HL60 et HL60ont été marquées avec un anti-CD11b-AF700 ou un anti-CD38-APC, suivi d’une analyse par cytométrie en f...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	Référence 21875-034
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco Invitrogen	Référence 10270-106
Solution saline tamponnée au phosphate (le PBS contient du calcium et du magnésium)	Gibco Invitrogen	Référence 14040-091
Vincristine	EG labo
Matrice de membrane basale BD Matrigel	BD Biosciences	354234	Mettre à 4 oC toute la nuit avant le jour de l’expérience
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Acide rétinoïque	Sigma-Aldrich	R2625
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Kit de coloration Annexing V-FLOUS	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Kit de coloration Giemsa modifié	Cosmos Biomédical	CB361550-0000
Cytométrie en flux LSRII	BD Biosciences
Cytocentrifugeuse	Thermo Scientific
Microscope Leica DMR-XA	Microsystèmes Leica
Compteur de viabilité des cellules Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience