Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Inoculation de souris C57BL/6 avec des cellules tumorales exprimant l’Ag T
- Cultiver la lignée cellulaire de fibrosarcome C57SV transformée en SV40 (ou une lignée cellulaire similaire adhérente à T Ag+) dans un milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de D-glucose et de L-glutamine (1x) et complété par 1 mM de pyruvate de sodium et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) inactivé par la chaleur dans des flacons traités par culture tissulaire à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 10 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Une fois que les cellules sont complètement confluentes ou légèrement surconfluentes, retirez et jetez délicatement le milieu et rincez la monocouche avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile préchauffée.
REMARQUE : L’expression maximale de T Ag est atteinte lorsque les cellules T Ag+ atteignent une confluence de 100 %.
- À l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, ajoutez de l’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (trypsine-EDTA) préchauffé (0,25 %) pour couvrir la monocouche à température ambiante jusqu’à ce que les cellules soient délogées en plaques. Tapotez plusieurs fois les côtés du ou des ballons de culture pour libérer les cellules adhérentes restantes.
REMARQUE : Si nécessaire et pour accélérer le processus de trypsinisation, transférez le(s) flacon(s) dans un incubateur à 37 °C. Les cellules délogées adopteront rapidement une forme arrondie au microscope optique. Cette étape devrait durer environ 5 min.
- Ajouter 5 mL de milieu DMEM et dissocier les amas pour préparer une suspension unicellulaire en pipetant le contenu de chaque fiole de haut en bas.
- Transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire avec des pores de 70 μm dans un tube.
- Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans 10 mL de PBS stérile et froid.
- Répétez deux fois les étapes 1.6 et 1.7.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Préparez une suspension uniforme contenant 4 x 107 cellules/mL de PBS stérile.
- Injecter 500 μL de la suspension ci-dessus par voie intrapéritonéale (i.p.) dans chaque souris C57BL/6 adulte (âgée de 6 à 12 semaines), mâle ou femelle.
2. Schémas thérapeutiques
- Schéma thérapeutique visant à examiner la contribution des cellules nTreg à l’immunodominance desT CD8
- Quatre jours avant l’amorçage in vivo de souris C57BL/6 avec des cellules C57SV (étape 1.10), injecter une fois par injection intraveineuse à chaque animal 0,5 mg d’un anticorps monoclonal (mAb) anti-CD25 à faible teneur en endotoxines et sans azoture (clone PC-61.5.3), qui épuise les cellules nTreg, ou avec un contrôle d’isotype IgG1 chez le rat (par exemple, clone KLH/G1-2-2, clone HRPN ou clone TNP6A7).
- Schéma thérapeutique pour tester l’importance in vivo des interactions des protéines de mort cellulaire programmées (-1--L1(2)) dans la formation de l’immunodominance TCD8
REMARQUE : L’engagement de-1 par-L1 médie souvent, mais pas toujours, la co-inhibition et/ou l’épuisement du TCD8 spécifique de l’Ag. Par conséquent, le traitement par anti--1 peut être effectué en parallèle avec l’administration d’anticorps monoclonaux anti--L1 et anti--L2 pour révéler l’interaction intercellulaire exacte impliquée dans un phénomène biologique.
3. Préparation des splénocytes cibles
- Euthanasier des souris C57BL/6 naïves de sexe égal (âgées de 6 à 12 semaines) qui serviront de donneurs de splénocytes par luxation cervicale.
- Placez chaque souris avec son abdomen vers le haut à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique. Vaporisez la peau avec de l’éthanol à 70 % (v/v), EtOH. À l’aide d’une pince stérile et de ciseaux, soulevez la peau et faites une petite incision ventrale médiane. Ensuite, coupez la peau en croix pour exposer le péritoine.
- À l’aide d’une pince, tirez le péritoine vers le haut comme une tente sans arracher aucun des organes internes. Ouvrez le péritoine pour exposer la cavité péritonéale et retirez doucement la rate.
- Placez la rate dans un broyeur de tissus Dounce de 15 ml contenant 5 ml de PBS stérile. Appliquez une pression manuelle à l'aide du piston en verre du broyeur jusqu'à ce que le tissu splénique se dissipe en une suspension cellulaire homogène rouge.
REMARQUE : Selon le nombre d’animaux receveurs par groupe expérimental, plusieurs rates de souris donneuses peuvent être nécessaires pour la préparation des cellules cibles. Jusqu’à 3 rates peuvent être homogénéisées ensemble à l’intérieur d’un broyeur de 15 ml.
- Transvasez l’homogénat dans un tube de 15 ml. Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans 4 mL de tampon de lyse d’ammonium-chlorure de potassium (ACK) pendant 4 min pour éliminer les érythrocytes.
REMARQUE : Il s’agit d’une étape sensible au temps. Une surexposition des splénocytes au tampon de lyse ACK augmentera leur fragilité et les rendra sensibles à la mort cellulaire non spécifique.
- Dans chaque tube, ajoutez 8 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur, de L-alanyl-L-glutamine, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels (MEM), 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthananesulfonique (HEPES) et 1x pénicilline/streptomycine, qui sera ci-après appelé milieu RPMI complet (Table of Materials).
- Transférez le contenu à travers les pores de 70 μm d’une passoire cellulaire dans un nouveau tube de 15 mL.
- Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans 12 mL de RPMI complet.
- Divisez la suspension de splénocytes en 3 portions égales (4 ml chacune) dans 3 tubes séparés.
4. Enrobage des splénocytes cibles avec des peptides non pertinents et apparentés
- Étiquetez les tubes en fonction des peptides qui seront utilisés pour pulser les splénocytes cibles. Les splénocytes témoins seront pulsés avec un peptide non pertinent, et chaque population de splénocytes cibles apparentés sera pulsée avec un peptide synthétique correspondant à l’épitope immunodominant dérivé de l’Ag T (site IV) ou à un épitope T Ag sous-dominant (site I ou site II/III) (Tableau 1).
REMARQUE : Le choix des peptides non pertinents dépend du dispositif expérimental et de la souche de souris utilisée dans chaque étude. Les auteurs utilisent souvent gB498-505 (un épitope peptidique immunodominant H-2Krestreint du virus de l’herpès simplex [HSV]-1) et/ou GP33-41 (un épitope peptidique immunodominant H-2Drestreint au virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV]) chez les souris C57BL/6 (tableau 1). Ces peptides sont des choix optimaux parce que : (i) ils sont dérivés d’agents pathogènes qui n’avaient pas été rencontrés auparavant dans le modèle murin décrit ici ; (ii) à l’instar des peptides dérivés du T Ag, les gB498-505 et GP33-41 sont limités par les molécules H-2b et se lient à celles-ci. Dans les essais de destruction in vivo à « trois pics », chacun des deux pics qui correspondent à des cellules cibles apparentées peut représenter des splénocytes pulsés avec un peptide immunodominant ou sous-dominant. Le choix de chaque ensemble de peptides varie en fonction des objectifs de chaque expérience. Voir les figures 1 et 2 comme exemples d’une telle variation. Pour le reste de ce protocole, les sites I et IV dérivés de T Ag représenteront respectivement des peptides sous-dominants et immunodominants.
- Pulsez le contenu de chaque tube marqué avec 1 μM du peptide respectif pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Utilisez une crépine à cellules distincte (avec des pores de 70 μm) pour chaque tube afin d’éliminer les amas et les débris si nécessaire.
- Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules granulées dans 12 mL de PBS froid stérile et répéter l’étape 4.4 une fois de plus.
REMARQUE : Il est important d’enlever autant de FBS que possible car FBS peut lier l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) à l’étape suivante.
5. Marquage des splénocytes cibles avec CFSE
- Mettre en suspension des splénocytes à impulsions de peptides dans 4 mL de PBS stérile.
- Ajoutez CFSE à 0,025 μM, 0,25 μM et 2 μM dans les tubes contenant des splénocytes pulsés de peptide, de site I et de site IV non pertinents, respectivement.
REMARQUE : Pour obtenir un étiquetage CFSE uniforme, tenez chaque tube à un angle de 45° avant d’ajouter CFSE sur le côté légèrement au-dessus de la suspension de la cellule, suivi immédiatement d’un léger vortex. Cela garantira l’apparition d’histogrammes lisses à la fin. Il n’est pas rare que les variations de l’intensité de l’ECSE varient d’un lot à l’autre et en fonction de l’âge. Par conséquent, il peut être nécessaire d’expérimenter avec des doses différentielles de CFSE avant de décider des concentrations optimales à utiliser.
prudence: Le CFSE est toxique à des concentrations supérieures à 5 μM.
- Placez les tubes à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C pendant 15 min et retournez-les une fois toutes les 5 min.
- Ajoutez 3 ml de FBS inactivé par la chaleur dans chaque tube pour arrêter la réaction CFSE. Complétez le contenu avec du PBS stérile.
- Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules granulées dans 12 mL de PBS stérile et répéter l’étape 5.5.
6. Examen du marquage CFSE adéquat/égal des populations de splénocytes cibles
- Remettre en suspension les cellules granulées dans 3 mL de PBS.
- Vortex doucement les tubes. Transvaser 10 μL de suspensions CFSEà cellules basses, CFSEintermédiaires (int) et CFSEà cellules élevées dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en polystyrène à fond rond de 5 mL contenant 200 μL DE PBS.
- Interrogez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser de 488 nm. Dessinez une porte lymphocytaire basée sur les propriétés de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) des cellules avant d’acquérir 5000 événements tombant dans la porte lymphocytaire dans le canal FL-1.
- Au sein de la population « parente » CFSE+, dessinez des portes d'histogramme supplémentaires pour identifier les sous-populationsCFSE faible, CFSEint et CFSEélevée.
- Confirmez les numéros d’événements égaux ou presque égaux dans les trois portes. Si nécessaire, ajustez le nombre de cellules dans les tubes « sources » (étape 6.1) avant de mélanger et d'injecter les splénocytes cibles chez les souris naïves et amorcées dans la section 7.
7. Injection de cellules cibles marquées au CFSE chez des receveurs naïfs et amorcés au T-Ag
- Tourbillonnez doucement les tubes sources. Transférez les trois suspensions cellulaires marquées CFSE dans des proportions égales dans un nouveau tube.
- Complétez le contenu avec du PBS stérile.
- Faites tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les cellules granulées avec du PBS stérile.
- Compter les cellules en bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre pour assurer une viabilité cellulaire d’au moins 95 %.
- Ajuster le volume afin d’injecter 1 x 107 cellules cibles mixtes/200 μL de PBS par voie intraveineuse (i.v.), via la veine de la queue, dans chaque souris C57BL/6 receveur.
REMARQUE : Conservez les cellules sur de la glace entre les injections. Mélangez délicatement les cellules cibles avant chaque injection. Notez le moment exact de l’injection pour chaque souris, ce qui déterminera quand l’animal devra être euthanasié. Il est important de maintenir la durée de la cytotoxicité in vivo cohérente chez tous les animaux d’une même expérience.
8. Acquisition de données
- Deux ou quatre heures après l’injection de cellules cibles marquées au CFSE, euthanasier les souris receveuses par luxation cervicale.
REMARQUE : La durée de la cytotoxicité in vivo peut varier en fonction du système expérimental utilisé, de l’immunogénicité des Ags cibles, de l’abondance prévue de TCD8 spécifiques de l’antigène peptidique dans la rate et de la robustesse de leur fonction lytique, entre autres facteurs.
- Retirez et traitez chaque rate séparément comme aux étapes 3.2 à 3.9.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées dans 3 mL de PBS.
REMARQUE : Prenez des précautions supplémentaires de manipuler le tissu splénique et les préparations cellulaires à 4 °C ou sur de la glace avant les analyses cytofluorimétriques. Il s’agit d’éviter une cytotoxicité continue ex vivo.
- Transférez environ 1x107 cellules de chaque rate traitée dans un tube FACS propre.
- Interrogez immédiatement les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser de 488 nm. Dessinez une porte lymphocytaire basée sur les propriétés FSC et SSC des cellules.
- Identifiez les splénocytes du receveur de CFSE- et les cellules cibles transférées par CFSE+. Dessinez des portes supplémentaires pour accueillir des populations cellulaires cibles distinctes de CFSEfaible, de CFSEint et deCFSE élevé.
- Acquérir un total de 2000 événements CFSEbas dans le canal FL-1.
9. Analyse des données
- Calculez la lyse spécifique de chaque population cellulaire cible apparentée à l’aide de la formule suivante :
% Cytotoxicité spécifique = 
Table 1. Peptides introduits dans ce protocole.
| Source d’antigène protéique | Épitope peptidique | désignation | séquence | Restriction du CMH I |
| SV401 Grand T Ag2 | T Ag206-215 | Site I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 Grand T Ag | T Ag223-231 | Site II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 Grand T Ag | T Ag404-411 | Site IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 Grand T Ag | T Ag489-497 | Site V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 Glycoprotéine B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL | H-2Kb |
| Glycoprotéine LCMV4 | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2Db |
| 1Virus simien 40 | | | | |
| 2antigène tumoral de grande taille | | | | |
| 3Virus de l’herpès simplex de type 1 | | | |
| 4Virus de la chorioméningite lymphoïde | | | |
| *utilisé comme un peptide non pertinent | | | |
