Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

Remarque : Le plasmide utilisé Lifeact-mCherry est un don aimable du Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris.

1. Cellules et transfection

Remarque : Les macrophages RAW264.7 sont cultivés jusqu’à la sous-confluence en milieu complet (milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-Glutamine et 10 % de FCS (sérum de veau fœtal)) dans une plaque de 100 mm. Ils sont transfectés avec des plasmides codant pour des protéines marquées par fluorescence par électroporation. Habituellement, environ 5 à 6 x 10^{cellules 6} sont transfectées avec 20 μg ou 10 μg de plasmide pour chaque transfection ou co-transfection respectivement. Notez que d’autres moyens de transfection basés sur l’électroporation ou la lipofection peuvent être utilisés comme approches alternatives.

1. Grattez les cellules à l’aide d’un extracteur de cellules et mettez-les en suspension dans 10 ml de milieu de culture en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
2. Centrifuger la suspension de cellule 300 x g, 5 min à RT en rotor d’angle de balancement.
3. Préchauffer 10 ml de milieu complet complété par 10 μg/ml de gentamicine à 37 °C.
4. Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 ml de « tampon de lavage A » du kit d’électroporation.
5. Centrifuger la suspension de la cellule 300 x g, 5 min à température ambiante dans un rotor à angle d’oscillation.
6. Pendant ce temps, préparez le mélange d’ADN à température ambiante : 120 μl 2x Buffer B, 20 μg d’ADN plasmidique codant pour la protéine d’intérêt, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Après la centrifugation, jeter tout le surnageant.
8. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans le mélange d’ADN et la transférer dans des cuvettes d’électroporation de 4 mm.
9. Incuber à RT pendant 3 min.
10. Électroporate à 250 V, 900 μF.
11. Remettez immédiatement les cellules en suspension dans le milieu complet préchauffé (37 °C) complété par de la gentamicine et placez-les dans une coupelle de 100 mm.
12. Incuber les cellules transfectées pendant la nuit à 37 °C, 5 % CO₂.
13. Le lendemain matin, remplacez le milieu complet par 10 ml de milieu de microscopie sans sérum (RPMI 1640 sans rouge de phénol, 10 mM HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-Glutamine).

2. Opsonisation des globules rouges

Remarque : Comme modèle de cible de particules pour les macrophages, les globules rouges de mouton (SRBC) sont utilisés. Habituellement, environ 7 x 10⁶ SRBC par plat à fond en verre de 35 mm sont utilisés.

1. Laver les SRBC avec 100 μl de 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)/0,1 % BSA (albumine sérique bovine) et centrifuger (600 x g, 4 min).
2. Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre les SRBC en suspension dans 100 μl de 1 PBS/0,1 % BSA et centrifuger (600 x g, 4 min).
3. Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension les SRBC dans 1x PBS/0,1 % BSA avec des anti-SRBC IgG de lapin à la concentration sous-agglutinante. Utiliser 500 μl de solution contenant des anticorps / 5 μl de SRBCs.
   note: La concentration sous-agglutinante des anticorps correspond à la concentration la plus faible qui n’a pas induit l’agglutination détectée comme la formation d’un réseau. En général, la concentration sous-agglutinante est de 8,2 μg/ml.
   1. Déterminer la concentration d’IgG anti-SRBC nécessaire pour opsoniser les SRBC par un test d’hémagglutination. Diluer en série les anti-SRBC IgG (stock à 13,1 mg/ml) entre 1/50 et 1/25 600 dans une microplaque. Ajouter 2 x 10⁶ SRBC dans chaque puits. Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant plusieurs heures.
4. Incuber à RT pendant 30 minutes avec une rotation lente.
5. Après deux lavages dans 1 PBS/0,1 % BSA comme décrit ci-dessus, remettre en suspension les SRBC opsonisés IgG (IgG-SRBC) dans un milieu de microscopie sans sérum préchauffé (2 ml/boîte).

3. Revêtement en polylysine des lamelles

1. Pendant ce temps, traitez les plats à fond de verre de 35 mm avec 2 ml de poly-L-lysine à 0,01 % pendant 30 min à température ambiante.
2. Lavez la vaisselle deux fois avec 2 ml de 1x PBS.

4. Fixation non covalente des SRBC sur des plats à fond de verre

1. Verser 2 ml de suspension SRBC par plat à fond de verre de 35 mm.
2. Centrifugeuse à rotor oscillant à 500 x g pendant 2 min sur des plats à fond de verre de 35 mm.
3. Retirez le surnageant et lavez-le une fois avec 2 ml de 1x PBS/10 % BSA.
4. Incuber les particules pendant 30 min avec 2 ml de 1x PBS/10 % BSA par plat.
5. Lavez la vaisselle trois fois avec 2 ml de 1x PBS.
6. Remplacer 1 PBS par 2 ml de milieu de microscopie sans sérum préchauffé (37 °C).

5. Phagocytose visualisée par TIRFM

1. Microscope
   note: La TIRFM a été réalisée à l’aide d’un microscope équipé d’un objectif à immersion dans l’huile (N 100X, NA1.49), d’une chambre de chauffe au CO₂ et de deux caméras de détection de photons uniques EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) couplées à un objectif 1,5X.
   1. La veille de la séance de microscope TIRF, allumez la chambre de chauffe à 37 ºC pour permettre un chauffage homogène de la platine du microscope.
2. Détermination de l’angle critique
   note: Le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d’images TIRF.
   1. Placez sous le microscope une parabole à fond en verre de 35 mm contenant un support de microscopie sans sérum opsonisé.
   2. Grattez les cellules et mettez-les en suspension dans le milieu avant de les ajouter (100 - 500 μl) dans le plat.
   3. Utilisez le logiciel « Live Acquisition » pour contrôler le microscope et effectuer une excitation avec un laser de 491 nm et/ou 561 nm pour identifier les cellules exprimant des protéines marquées par fluorescence.
   4. Identifiez une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence.
   5. Placez-le au milieu du champ et acquérez 500 images à une longueur d’onde d’excitation, avec différents angles allant de 0º à 5º, avec un incrément de 0,01º (Figure 1A). Les angles sont automatiquement modifiés par le système de microscope.
   6. Déterminer l’angle critique permettant à la lumière incidente d’être totalement réfléchie à l’interface verre/milieu et de générer l’onde évanescente. À l’aide du logiciel ImageJ Color Profiler, ouvrez la séquence d’images en cliquant sur « Fichier », « Ouvrir » et sélectionnez le fichier.
   7. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI), à l’aide de l’outil rectangulaire, dans la cellule avec une fluorescence uniforme (Figure 1B jaune 1).
   8. Tracez l’intensité moyenne de fluorescence du « profil de l’axe Z » mesurée dans le ROI avec fonction des angles sur l’axe des x en cliquant sur l’onglet « Image », « Piles » dans le menu déroulant et « Tracer le profil de l’axe Z » (Figure 1B rouge 2).
      Remarque : L’angle critique est l’angle conduisant à la fluorescence maximale avant une forte diminution de la fluorescence.
   9. Utilisez n’importe quelle valeur d’angle sur l’axe des x supérieure à l’angle critique pendant la séance de microscopie pour obtenir un signal TIRF, comme par exemple 2.00 (Figure 1C).
3. Acquisitions
   1. A l’aide du logiciel Live Acquisition, paramétrez les paramètres d’acquisition avec le module « Protocol Editor » (Figure 2A).
      1. Créer un protocole avec une « boucle » comprenant l’acquisition de « Multi Canaux » pour acquérir un signal fluorescent à partir de protéines d’intérêt dans la région TIRF. Entrez l’angle TIRF (par exemple 2,00), le temps d’exposition (par exemple 50 ms) et l’intensité laser (par exemple 50 %) (Figure 2B 1).
      2. Introduire un « déplacement Z » de l’objectif de 3 μm au-dessus de la région TIRF pour obtenir l’acquisition du signal en épifluorescence avec l’outil « Multi Canaux ». Entrez un angle inférieur à l’angle critique (par exemple 1,00), au temps d’exposition (50 ms) et à l’intensité laser (50 %) (Figure 2B, 2 et 3).
      3. Ensuite, ajoutez un « mouvement z » de l’objectif 3 μm ci-dessous, pour revenir dans la région TIRF (Figure 3B 4). Ajoutez un « instantané » de la pile en LED (diode électroluminescente) à lumière vive (Figure 2B 5).
   2. Trouvez une cellule d’intérêt avec un niveau modéré d’expression protéique marquée par fluorescence qui initie la phagocytose de la SRBC en étendant la membrane plasmique autour de la particule.
   3. Placez-le au milieu du terrain.
   4. Lancez l’acquisition en streaming de 500 à 1 000 images. Dans l’onglet « Nombre de boucles », entrez « 750 trames » (Figure 2B 1).
      note: Le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d’images TIRF.
   5. Ouvrez les images de séquence dans le logiciel Image J en cliquant sur « Fichier », « Ouvrir » et en choisissant le fichier.
   6. Séparez les canaux en cliquant sur l’onglet « Image », le menu déroulant « Hyperstacks » et sur la fonction « Stack to hyperstack ». Complétez la fenêtre qui apparaît : Ordre : xyctz ; Canal (c) : nombre de canaux (ex : « 2 » si vous avez deux fluorochromes) ; Tranches (z) : nombre de tranches dans l’axe z (ex : « 1 » s’il n’y a pas de mouvement dans l’axe z) ; Cadres (t) : nombre d’images divisé par nombre de canaux ; Mode d’affichage : Niveaux de gris.
      note: Deux séquences d’images distinctes sont générées, correspondant aux deux canaux différents.

Graphique 1. Représentation schématique du « test de fermeture du phagosome » analysé par le TIRFM. Le test de fermeture du phagosome est effectué à l’aide de macrophages exprimant transitoirement une ou deux protéines marquées par fluorescence. Les macrophages se déposent sur des SRBC opsonisés en IgG fixés de manière non covalente sur des lamelles enrobées de polylysine. Les images sont enregistrées en mode TIRF pour détecter le site de fermeture du phagosome et en mode épifluorescence pour détecter la base de la cupule phagocytaire.

Figure 2 : Détermination de l’angle critique pour le TIRFM. (A) À l’aide de « l’acquisition en direct », une cellule exprimant des protéines marquées par fluorescence est placée au milieu du champ (région 1 en rouge). Avec l’option TIRF Stack, les images ont été acquises à une longueur d’onde d’excitation, avec différents angles allant de 0° à 5°, avec un incrément de 0,01° (région 2 en rouge). (B) La séquence d’images est ouverte à l’aide du logiciel ImageJ Color Profiler et l’intensité moyenne de fluorescence d’une région d’intérêt (ROI) est tracée en fonction des angles sur l’axe x à l’aide de « Stacks » et « PlotZ axis profile » (région 1 en rouge). (C) La position x du pic de fluorescence sur le graphique correspond à l’angle critique : 1,98° (pointillé noir). N’importe quelle valeur après cet angle peut être utilisée. À titre d’exemple, 2,00° peut être choisi (ligne rouge).

Graphique 3. Processus de flux de travail à l’aide du module d’acquisition en direct : « Éditeur de protocole ». (A) Dans la fenêtre « Éditeur de protocole », un canevas de flux de travail est créé. (B) Ce protocole comprend une « boucle » d’actions que le microscope répétera le nombre de fois décidé par l’utilisateur. À titre d’exemple : 750 (1). Une boucle incluse : acquisition « Multi Channels » avec excitation laser de protéines fluorescentes d’intérêt en mode TIRF. Par exemple : Laser 491 nm intensité 50 % -TIRF angle 2.00 (2) ; « Z move » de l’objectif 3 μm (3) ; Acquisition « Multi Canaux » en mode épifluorescence (4) ; « Z » déplacement de l’objectif vers la région TIRF (5) et un « instantané » en lumière transmise (6).