Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
Remarque : Le plasmide utilisé Lifeact-mCherry est un don aimable du Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris.
1. Cellules et transfection
Remarque : Les macrophages RAW264.7 sont cultivés jusqu’à la sous-confluence en milieu complet (milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-Glutamine et 10 % de FCS (sérum de veau fœtal)) dans une plaque de 100 mm. Ils sont transfectés avec des plasmides codant pour des protéines marquées par fluorescence par électroporation. Habituellement, environ 5 à 6 x 10cellules 6 sont transfectées avec 20 μg ou 10 μg de plasmide pour chaque transfection ou co-transfection respectivement. Notez que d’autres moyens de transfection basés sur l’électroporation ou la lipofection peuvent être utilisés comme approches alternatives.
- Grattez les cellules à l’aide d’un extracteur de cellules et mettez-les en suspension dans 10 ml de milieu de culture en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
- Centrifuger la suspension de cellule 300 x g, 5 min à RT en rotor d’angle de balancement.
- Préchauffer 10 ml de milieu complet complété par 10 μg/ml de gentamicine à 37 °C.
- Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 ml de « tampon de lavage A » du kit d’électroporation.
- Centrifuger la suspension de la cellule 300 x g, 5 min à température ambiante dans un rotor à angle d’oscillation.
- Pendant ce temps, préparez le mélange d’ADN à température ambiante : 120 μl 2x Buffer B, 20 μg d’ADN plasmidique codant pour la protéine d’intérêt, q.s.p. 240 μl H2O.
- Après la centrifugation, jeter tout le surnageant.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans le mélange d’ADN et la transférer dans des cuvettes d’électroporation de 4 mm.
- Incuber à RT pendant 3 min.
- Électroporate à 250 V, 900 μF.
- Remettez immédiatement les cellules en suspension dans le milieu complet préchauffé (37 °C) complété par de la gentamicine et placez-les dans une coupelle de 100 mm.
- Incuber les cellules transfectées pendant la nuit à 37 °C, 5 % CO2.
- Le lendemain matin, remplacez le milieu complet par 10 ml de milieu de microscopie sans sérum (RPMI 1640 sans rouge de phénol, 10 mM HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-Glutamine).
2. Opsonisation des globules rouges
Remarque : Comme modèle de cible de particules pour les macrophages, les globules rouges de mouton (SRBC) sont utilisés. Habituellement, environ 7 x 106 SRBC par plat à fond en verre de 35 mm sont utilisés.
- Laver les SRBC avec 100 μl de 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)/0,1 % BSA (albumine sérique bovine) et centrifuger (600 x g, 4 min).
- Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre les SRBC en suspension dans 100 μl de 1 PBS/0,1 % BSA et centrifuger (600 x g, 4 min).
- Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension les SRBC dans 1x PBS/0,1 % BSA avec des anti-SRBC IgG de lapin à la concentration sous-agglutinante. Utiliser 500 μl de solution contenant des anticorps / 5 μl de SRBCs.
note: La concentration sous-agglutinante des anticorps correspond à la concentration la plus faible qui n’a pas induit l’agglutination détectée comme la formation d’un réseau. En général, la concentration sous-agglutinante est de 8,2 μg/ml.
- Déterminer la concentration d’IgG anti-SRBC nécessaire pour opsoniser les SRBC par un test d’hémagglutination. Diluer en série les anti-SRBC IgG (stock à 13,1 mg/ml) entre 1/50 et 1/25 600 dans une microplaque. Ajouter 2 x 106 SRBC dans chaque puits. Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant plusieurs heures.
- Incuber à RT pendant 30 minutes avec une rotation lente.
- Après deux lavages dans 1 PBS/0,1 % BSA comme décrit ci-dessus, remettre en suspension les SRBC opsonisés IgG (IgG-SRBC) dans un milieu de microscopie sans sérum préchauffé (2 ml/boîte).
3. Revêtement en polylysine des lamelles
- Pendant ce temps, traitez les plats à fond de verre de 35 mm avec 2 ml de poly-L-lysine à 0,01 % pendant 30 min à température ambiante.
- Lavez la vaisselle deux fois avec 2 ml de 1x PBS.
4. Fixation non covalente des SRBC sur des plats à fond de verre
- Verser 2 ml de suspension SRBC par plat à fond de verre de 35 mm.
- Centrifugeuse à rotor oscillant à 500 x g pendant 2 min sur des plats à fond de verre de 35 mm.
- Retirez le surnageant et lavez-le une fois avec 2 ml de 1x PBS/10 % BSA.
- Incuber les particules pendant 30 min avec 2 ml de 1x PBS/10 % BSA par plat.
- Lavez la vaisselle trois fois avec 2 ml de 1x PBS.
- Remplacer 1 PBS par 2 ml de milieu de microscopie sans sérum préchauffé (37 °C).
5. Phagocytose visualisée par TIRFM
- Microscope
note: La TIRFM a été réalisée à l’aide d’un microscope équipé d’un objectif à immersion dans l’huile (N 100X, NA1.49), d’une chambre de chauffe au CO2 et de deux caméras de détection de photons uniques EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) couplées à un objectif 1,5X.
- La veille de la séance de microscope TIRF, allumez la chambre de chauffe à 37 ºC pour permettre un chauffage homogène de la platine du microscope.
- Détermination de l’angle critique
note: Le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d’images TIRF.
- Placez sous le microscope une parabole à fond en verre de 35 mm contenant un support de microscopie sans sérum opsonisé.
- Grattez les cellules et mettez-les en suspension dans le milieu avant de les ajouter (100 - 500 μl) dans le plat.
- Utilisez le logiciel « Live Acquisition » pour contrôler le microscope et effectuer une excitation avec un laser de 491 nm et/ou 561 nm pour identifier les cellules exprimant des protéines marquées par fluorescence.
- Identifiez une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence.
- Placez-le au milieu du champ et acquérez 500 images à une longueur d’onde d’excitation, avec différents angles allant de 0º à 5º, avec un incrément de 0,01º (Figure 1A). Les angles sont automatiquement modifiés par le système de microscope.
- Déterminer l’angle critique permettant à la lumière incidente d’être totalement réfléchie à l’interface verre/milieu et de générer l’onde évanescente. À l’aide du logiciel ImageJ Color Profiler, ouvrez la séquence d’images en cliquant sur « Fichier », « Ouvrir » et sélectionnez le fichier.
- Sélectionnez une région d’intérêt (ROI), à l’aide de l’outil rectangulaire, dans la cellule avec une fluorescence uniforme (Figure 1B jaune 1).
- Tracez l’intensité moyenne de fluorescence du « profil de l’axe Z » mesurée dans le ROI avec fonction des angles sur l’axe des x en cliquant sur l’onglet « Image », « Piles » dans le menu déroulant et « Tracer le profil de l’axe Z » (Figure 1B rouge 2).
Remarque : L’angle critique est l’angle conduisant à la fluorescence maximale avant une forte diminution de la fluorescence.
- Utilisez n’importe quelle valeur d’angle sur l’axe des x supérieure à l’angle critique pendant la séance de microscopie pour obtenir un signal TIRF, comme par exemple 2.00 (Figure 1C).
- Acquisitions
- A l’aide du logiciel Live Acquisition, paramétrez les paramètres d’acquisition avec le module « Protocol Editor » (Figure 2A).
- Créer un protocole avec une « boucle » comprenant l’acquisition de « Multi Canaux » pour acquérir un signal fluorescent à partir de protéines d’intérêt dans la région TIRF. Entrez l’angle TIRF (par exemple 2,00), le temps d’exposition (par exemple 50 ms) et l’intensité laser (par exemple 50 %) (Figure 2B 1).
- Introduire un « déplacement Z » de l’objectif de 3 μm au-dessus de la région TIRF pour obtenir l’acquisition du signal en épifluorescence avec l’outil « Multi Canaux ». Entrez un angle inférieur à l’angle critique (par exemple 1,00), au temps d’exposition (50 ms) et à l’intensité laser (50 %) (Figure 2B, 2 et 3).
- Ensuite, ajoutez un « mouvement z » de l’objectif 3 μm ci-dessous, pour revenir dans la région TIRF (Figure 3B 4). Ajoutez un « instantané » de la pile en LED (diode électroluminescente) à lumière vive (Figure 2B 5).
- Trouvez une cellule d’intérêt avec un niveau modéré d’expression protéique marquée par fluorescence qui initie la phagocytose de la SRBC en étendant la membrane plasmique autour de la particule.
- Placez-le au milieu du terrain.
- Lancez l’acquisition en streaming de 500 à 1 000 images. Dans l’onglet « Nombre de boucles », entrez « 750 trames » (Figure 2B 1).
note: Le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d’images TIRF.
- Ouvrez les images de séquence dans le logiciel Image J en cliquant sur « Fichier », « Ouvrir » et en choisissant le fichier.
- Séparez les canaux en cliquant sur l’onglet « Image », le menu déroulant « Hyperstacks » et sur la fonction « Stack to hyperstack ». Complétez la fenêtre qui apparaît : Ordre : xyctz ; Canal (c) : nombre de canaux (ex : « 2 » si vous avez deux fluorochromes) ; Tranches (z) : nombre de tranches dans l’axe z (ex : « 1 » s’il n’y a pas de mouvement dans l’axe z) ; Cadres (t) : nombre d’images divisé par nombre de canaux ; Mode d’affichage : Niveaux de gris.
note: Deux séquences d’images distinctes sont générées, correspondant aux deux canaux différents.
