Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement par gradient de densité des cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC)
- Ajouter 25 ml de sang total hépariné dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette de 25 ml.
- Diluez les cellules avec 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 15 ml de gradient de densité Ficoll-Paque dans un nouveau tube de 50 ml et, tout en inclinant le tube, ajouter très lentement et soigneusement 25 ml de suspension cellulaire diluée sur le gradient de densité de manière à ce qu’il n’y ait pas de mélange du sang entier avec le gradient de densité, c’est-à-dire qu’il n’y a pas de perturbation de l’interface entre le gradient de densité sanguine et le gradient de densité.
- Centrifuger la suspension à partir de l’étape 1.2 à 400 × g pendant 30 à 40 min dans un rotor à godet oscillant à température contrôlée sans frein à 20 °C.
note: Trois couches distinctes doivent être apparentes après centrifugation : la couche supérieure étant le plasma ; la couche inférieure claire étant le gradient de densité Ficoll-Paque ; et une fine couche cellulaire intermédiaire étant les PBMC.
- Aspirez et jetez la couche supérieure par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas perturber la couche interphasique des cellules mononucléées (c’est-à-dire les lymphocytes, les monocytes et les plaquettes).
- Prélevez soigneusement cette couche de cellules mononucléées à l’aide d’une pipette de 10 ml dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml.
- Remplissez le tube avec 20 ml de PBS, mélangez bien et centrifugez à 300 × g pendant 10 min à 20°C. Retirez complètement le surnageant après centrifugation.
- Remettre la pastille en suspension dans 20 ml de PBS et la centrifuger à 200 × g pendant 10 à 15 min à 20 °C. Éliminer complètement le surnageant après la centrifugation.
note: Cette étape permet d’éliminer les plaquettes - qui ne sont pas désirées - dans les PBMC ; Cette étape peut être répétée pour assurer l’élimination complète des plaquettes.
- Si aucune sélection de populations spécifiques n’est souhaitée, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu complet leucocytaire (10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine dans le milieu RPMI-1640) pour la culture après avoir effectué une numération cellulaire pour suspendre 1 ml de milieu pour 107 PBMC avant de passer à l’étape suivante.
2. Marquage magnétique des populations de leucocytes
- Centrifuger la suspension PBMC à 300 × g pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant.
- Mettre en suspension les pastilles de cellules dans 80 μl de PBS pour 107 cellules au total.
- Ajouter 20 μl de billes magnétiques spécifiées (c.-à-d. billes magnétiques CD14 pour l’isolement des monocytes, billes magnétiques CD4 pour l’isolement des lymphocytes T) par 107 cellules au total.
- Bien mélanger et incuber 15 min à 2 à 8 °C au réfrigérateur.
- Ajouter 1 à 2 ml de PBS par 107 cellules à laver et centrifuger à 300 × g pendant 10 min.
- Aspirer complètement le surnageant et remettre en suspension jusqu’à 108 cellules dans 500 μl de PBS.
3. Sélection magnétique des sous-populations de leucocytes
Remarque : Une variété de séparateurs de billes magnétiques et de colonnes sont disponibles pour l’isolement d’une population spécifique de leucocytes par marqueur de surface cellulaire auprès d’un certain nombre de fabricants. L’isolement peut se faire par sélection positive basée sur un ou quelques marqueurs positifs ou par sélection négative après épuisement de populations indésirables. Une approche générale consistant à effectuer une sélection positive à l’aide d’un seul marqueur (c’est-à-dire CD4 pour les lymphocytes T auxiliaires, ou CD14 pour les monocytes) est décrite ci-dessous.
- Préparez et amorcez le séparateur magnétique, y compris la colonne de séparation, conformément aux instructions du fabricant.
- Fournir deux tubes à centrifuger de 15 ml pour le prélèvement des fractions cellulaires marquées positivement et non marquées, en suivant les instructions du fabricant.
- Compter le nombre de cellules et remettre en suspension les leucocytes sélectionnés positivement (c.-à-d. lymphocytes T CD4+ ou cellules CD14+) dans le milieu complet leucocytaire, en utilisant 1 ml de milieu pour 107 cellules.
4. Coloration des leucocytes à l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) pour l’évaluation de la prolifération
Remarque : Le CFSE a été largement utilisé dans les études immunologiques, tant pour les études in vivo qu’in vitro. Notre protocole a été optimisé pour l’étude in vitro des interactions MSC/PBMC (ou d’autres leucocytes). Bien que les étapes générales de la réalisation de l’étiquetage in vitro du CFSE soient similaires, il peut y avoir des différences dans la dose spécifique et le moment du protocole. Cela peut être dû à un certain nombre de facteurs, c’est-à-dire le type de cellule spécifique utilisé, le nombre de cellules utilisées, qui peuvent probablement affecter l’intensité du signal fluorescent CFSE.
- Diluer la solution mère CFSE (10 mM) dans du PBS jusqu’à la concentration de travail souhaitée de 10 μM (solution de travail CFSE). Préparez 10 à7 cellules (c’est-à-dire des PBMC ou des cellules T) pour le marquage avec la solution de travail CFSE.
- Centrifuger à 300 × g pendant 10 min pour obtenir une pastille cellulaire et aspirer le surnageant.
- Remettez doucement les cellules en suspension dans 1 ml de solution de travail CFSE préchauffée (37 °C) et incubez les cellules pendant 10 min à 37 °C.
- Pour éliminer l’excès de CFSE, diluez la suspension cellulaire avec 10x (en volume) de milieu RPMI prérefroidi (4 °C) contenant 10 % de FBS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Lavez la pastille cellulaire de cette manière deux fois de plus.
- Regranulez les cellules par centrifugation et comptez le nombre de cellules. Mettre en suspension 10à 7 cellules (PBMC ou lymphocytes T) dans 1 ml de milieu complet leucocytaire frais préchauffé.
5. Dosage de suppression effectrice Leucocytes immunomodulateurs sélectionnés par billes magnétiques et induits par MSC sur des cellules T effectrices CD4 + T activées marquées au CFSE
- Semez les CSM à 250 000 cellules dans 3 ml de milieu complet de CSM en plaques à 6 puits (densité des CSM : 25 000 cellules/cm2) pour la fixation O/N dans un incubateur à 37 °C, ce qui permet aux cellules souches d’atteindre une confluence de 80 %. Au moins 3 plaques à 6 puits sont nécessaires pour garantir un nombre suffisant de PBMC co-cultivés par CSM pour la sélection des sous-populations.
- Aspirer le milieu et ajouter les PBMC séparés selon l’étape 1, mais en plaques de 6 puits à 2,5 x 106 cellules/puits (densité cellulaire : 250 000 leucocytes/cm2) avec 3 ml de milieu complet leucocytaire. Co-culture pendant 48 à 72 heures dans un incubateur à 37 °C.
- Sélection par billes magnétiques d’une population spécifique de leucocytes immunomodulateurs induits par les CSM (c.-à-d. cellules CD14+) conformément aux sections 2-3.
note: La coloration intracellulaire des cytokines pour l’analyse cytométrique en flux peut être effectuée à ce stade pour évaluer les changements dans le profil d’expression des cytokines leucocytaires, c’est-à-dire l’expression de l’interleukine-10-telle que modulée par les CSM.
- Ajouter des lymphocytes T CD4+ allogéniques marqués par CFSE et générés conformément aux sections 2 à 4 dans des plaques de 24 puits dans 1 ml de milieu complet leucocytaire (densité des lymphocytes T : 250 000 cellules/cm2) à des leucocytes induits par des CSM sélectionnées par des billes à divers ratios, c’est-à-dire 1:10, 1:5, 1:2 et 1:1 (cellule à cellule).
- Pour stimuler les lymphocytes T CD4+, ajoutez des microbilles conjuguées α-CD3/28 pour obtenir un rapport billes / cellules de 1:1.
- Pour un contrôle négatif, plaquer 500 000 lymphocytes T CD4+/puits dans une plaque à 24 puits (densité des lymphocytes T : 250 000 cellules/cm2) avec 1 ml de milieu complet leucocytaire uniquement ; pour un contrôle positif, en plus de plaquer le même nombre de lymphocytes T CD4+/puits, ajouter des microbilles conjuguées α-CD3/28 pour obtenir un rapport billes / cellules de 1:1.
- Le 3ème jour de la co-culture, évaluer la prolifération des lymphocytes T CD4+ marqués au CFSE (placés dans des tubes à fond rond) par cytométrie en flux avec des filtres d’excitation et d’émission de 488 nm appropriés pour la fluorescéine.