Une étude in vitro de l’effet des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes

Résumé

Source : Munir, H. et al., Analyse des effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes à partir de l’écoulement. J. Vis. Exp.(2015)

La vidéo présente une méthode d’étude de l’impact des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes. Dans un modèle de chambre d’écoulement de plaques parallèles, les cytokines pro-inflammatoires induisent l’expression des récepteurs d’adhésion par les cellules endothéliales, facilitant le recrutement et la migration des neutrophiles. La diaphonie entre les cellules stromales et les cellules endothéliales diminue le recrutement des neutrophiles dans les cellules endothéliales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Isolement et culture de cellules endothéliales humaines primaires et de cellules souches mésenchymateuses

1. Isolement et culture de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) :
   1. Placez le cordon ombilical sur un plateau avec du papier absorbant et vaporisez-le avec de l’éthanol à 70 %. Placer dans une hotte de culture de tissus. Identifiez la veine et la canule aux deux extrémités. Placez un serre-câble autour de l’extrémité canulée pour la fixer.
   2. Laver le sang veineux avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une seringue. Remplissez la seringue d’air et passez-la dans la veine pour éliminer et jeter le PBS résiduel.
   3. Décongeler 10 mg/ml de collagénase de type Ia et diluer 1:10 dans du PBS (avec du chlorure de calcium et de magnésium) jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml. Passer la solution de collagénase dans la veine jusqu’à ce que les deux canules soient remplies. Fermez les pinces sur les canules aux deux extrémités.
   4. Couvrez le plateau d’un mouchoir en papier et vaporisez de l’éthanol à 70 %. Placez le cordon dans un incubateur pendant 20 min à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
   5. Sortez le cordon de l’incubateur et serrez les serre-câbles. Massez doucement le cordon pendant 1 min. Rincez la suspension cellulaire avec 10 ml de PBS et collectez dans un tube à centrifuger de 50 ml.
   6. Remplissez la seringue d’air et passez-la deux fois dans la veine pour éliminer tout PBS résiduel, en recueillant le PBS dans un tube à centrifuger de 50 ml utilisé à l’étape 1.1.5. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
   7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 ml de milieu complet de cellules endothéliales (CE). Le milieu EC se compose de M199 complété par 35 μg/ml de sulfate de gentamicine, 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique humain, 1 μg/ml d’hydrocortisone, 2,5 μg/ml d’amphotéricine B et 20 % de sérum de veau fœtal.
   8. Ajouter 4 ml de milieu EC et la suspension EC dans une fiole de²⁵ cm. Changez de support le lendemain puis tous les 2 jours.
   9. EC présente une morphologie semblable à celle d’un pavé (Figure 1Ai). Pour les essais d’adhésion, les CE sont généralement ensemencées lorsqu’elles atteignent 100 % de confluence (voir la section 1.4).
2. Isolement des cellules souches mésenchymateuses de Wharton (WJMSC) à partir de cordons ombilicaux humains :
   1. Isolez la CSM dérivée de la gelée de Wharton (WJMSC) à partir de cordons ombilicaux frais ou de cordons qui ont déjà été utilisés pour isoler la CE. Coupez le cordon ombilical en morceaux de 5 cm de long. Coupez chaque morceau longitudinalement pour révéler les vaisseaux sanguins (2 artères [blanches, rigides] et 1 veine [jaune, distendue]).
   2. À l’aide de ciseaux stériles et de pinces, retirez les vaisseaux sanguins et jetez-les. Coupez tout le tissu en³ morceaux de 2 à 3 mm. À l’aide d’une pince, placez³ morceaux de 2 à 3 mm dans un tube à centrifuger de 50 ml.
   3. Décongeler 100 mg/ml de glycolgénase de type II et diluer 1:100 dans 10 ml de PBS jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml. Décongeler 20 000 U/ml de glycolgénase glycolgénase et diluer 1:400 jusqu’à obtenir une concentration finale de 50 U/ml dans la solution de collagénase.
   4. Ajoutez un cocktail enzymatique dans le tube à centrifuger contenant les fragments de tissu. Incuber les fragments de tissu pendant 5 heures à 37 °C sur un rotateur lent.
   5. Diluer la suspension cellulaire 1:5 dans du PBS. Placez un filtre à pores de 100 μm dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml. Versez la suspension cellulaire sur le filtre à pores de 100 μm.
      note: Les fragments de tissu restants seront conservés sur le filtre et les cellules seront collectées dans le tube à centrifuger de 50 ml.
   6. Jetez le filtre. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 10 min à RT. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille WJMSC dans 12 ml de milieu de culture WJMSC complet (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM à faible teneur en glucose, 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 100 U/ml de pénicilline + 100 μg/ml de mélange de streptomycine).
   7. Ensemencer toutes les cellules dans une fiole de culture de² tissus de 75 cm. Changez le milieu après 24 heures avec 12 ml de milieu de culture WJMSC complet. Remplacez le support tous les 2 à 3 jours. Les cellules devraient atteindre 70 à 80 % de confluence en 2 semaines. Passage lorsque le WJMSC atteint 70 à 80 % de confluence (voir la section 1.4).
3. Expansion des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC) :
   1. Isolez les CSM dérivées de la moelle osseuse humaine (BMMSC) comme décrit précédemment. Ajouter 10 ml de cellules souches mésenchymateuses préchauffées, milieu de croissance MSC (MSCGM) dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   2. Décongelez un flacon de BMMSC p2 en le plaçant dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min. Ajoutez la suspension BMMSC dans le tube à centrifuger contenant MSCGM. Bien mélanger par pipetage.
   3. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à RT. Aspirer complètement le surnageant.
   4. Rémettez les cellules en suspension dans 1 ml de MSCGM et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules numérique tel qu’un cellomètre.
   5. Ensemencer les cellules dans des flacons de^{culture de 75 cm 2} à une densité de 5 000 à 6 000 cellules par^cm2 dans 12 ml de MSCGM. Changez le milieu après 24 heures avec 12 ml de MSCGM. Nourrir les cellules avec 12 ml de MSCGM tous les 2 à 3 jours.
   6. Passage lorsque la BMMSC atteint une confluence de 70 à 80 % (voir la section 1.4). Les cellules présentent une morphologie fibroblastique (Figure 1Aii).
4. Détachement de la CE et du MSC :
   1. Milieu d’aspiration de^{25 cm 2} flacons de culture. Ajouter 2 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,02 % pendant environ 2 min. Aspirez de l’EDTA et ajoutez 2 ml de trypsine (2,5 mg/ml). Observez au microscope jusqu’à ce que les cellules deviennent rondes.
   2. Tapotez le flacon pour détacher les cellules. Inactiver la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de culture (en fonction du type de cellule ; milieu EC pour HUVEC, DMEM LG pour WJMSC et MSCGM pour BMMSC) dans le ballon de culture et transfert de la suspension dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   3. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le surnageant et remettre le granulé en suspension comme décrit ci-dessous.
      1. Pour le passage de MSC, remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture de 3 ml. Ajouter 11 ml de milieu de culture dans trois flacons de culture séparés de^{75 cm 2}. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque flacon de culture (fractionné 1:3). Passage WJMSC et BMMSC 3 fois (p3) avant utilisation dans des essais de co-culture.
      2. Pour l’ensemencement EC ou MSC dans les essais d’adhérence – voir les sections 2 et 3.
5. Congélation des CSM :
   1. Au passage 3, détachez le MSC comme décrit à la section 1.4. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 3 ml de CryoSFM glacé. Pipeter 1 ml d’aliquotes de suspension cellulaire dans des cryoflacons glacés de 1,5 ml. Mettez les cryoflacons dans un récipient de congélation.
   2. Conservez le récipient à -80 °C O/N. Transférer dans de l’azote liquide. Décongeler un flacon de CSM (suivre les étapes 1.3.1 à 1.3.6). Remettre en suspension la CSM dans un milieu de culture de 5 ml (choisir le milieu approprié pour le WJMSC ou le BMMSC) et semer dans une fiole de^{25 cm 2}.

2. Etablissement de co-cultures de cellules souches endothéliales-mésenchymateuses sur des filtres

1. Détachez WJ ou BMMSC comme décrit à la section 1.4. Remettez la pastille en suspension dans 1 ml de MSCGM. Effectuez un comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un cellomètre.
2. Ajuster le volume de manière à ce que la concentration finale soit de 5 x 10⁵ MSC dans 500 μl de MSCGM.
3. À l’aide d’une pince stérile, inverser les filtres PET Transwell de 6 puits de 0,4 μm et les placer dans une boîte stérile.
4. Semez 5 x 10⁵ MSC sur la surface extérieure des filtres. Incuber les filtres à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 heure.
5. Récupérez le média sur la surface extérieure du filtre. Comptez le nombre de CSM non adhérentes dans les médias. Retournez les filtres à l’aide d’une pince stérile et placez-les dans une plaque à 6 puits correspondante contenant 3 ml de MSCGM.
6. Ajouter 2 ml de MSCGM sur la surface intérieure du filtre (Figure 1B). Placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 heures. Trypsiniser une fiole confluente de 25 cm² de CE (figure 1Ai ; voir la section 1.4).
7. Remettre l’EC en suspension dans 8 ml de MSCGM (1 x 25 cm² flacons ensemencera quatre filtres à 6 puits ; ~5 x 10⁵ EC/filtre). Aspirez le milieu par le haut et le bas des filtres poreux. Ajoutez 3 ml de MSCGM frais dans la chambre inférieure (sous le filtre). Ajoutez 2 ml de suspension EC sur la surface intérieure de chaque filtre. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
8. Aspirez le milieu pour éliminer l’EC non adhérent et remplacez-le par du MSCGM frais. Mettre en place des filtres EC parallèles en mono-culture en ensemencant des cellules sur la surface interne sans ensemencer au préalable des CSM. Incuber O/N à 37 °C et 5 % CO₂.
9. Vérifiez que la monocouche EC est confluente et ne contient pas d’espaces. Les monocouches sous-confluentes ne peuvent pas être utilisées pour les tests d’adhérence (Figure 1B).
10. Décongeler 1 x 10⁵ U/ml de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) et diluer 1:1 000 dans MSCGM jusqu’à une concentration finale de 100 U/ml (équivalent à ~10 ng/ml). Effectuer une dilution en série en diluant 100 U/ml de TNFα par 1:10 dans du MSCGM pour obtenir 10 U/ml. Diluer 10 U/ml de TNFα par 1:10 dans MSCGM pour obtenir 1 U/ml.
11. Traitez les chambres supérieure et inférieure des filtres avec 1, 10 ou 100 U/ml de TNFα (équivalent à ~10 ng/ml) à 37 °C pendant 4 heures avant le test.

3. Isolement des leucocytes

1. Prélever du sang veineux de volontaires sains et aliquote immédiatement dans des tubes EDTA. Retournez doucement les tubes pour mélanger.
2. Appliquez 2,5 ml d’Histopaque 1077 sur 2,5 ml d’Histopaque 1119 dans un tube à fond rond de 10 ml. Appliquez 5 ml de sang total sur le gradient histopaque. Centrifugeuse à 800 x g pendant 40 min à RT.
3. Récoltez les polytrophiles polynucléaires périphériques (PMN) à l’interface d’Histopaque 1077 et 1119 (au-dessus de la couche érythrocytaire). Placer dans un tube à fond rond de 10 ml et maquiller à 10 ml avec du PBSA. Retournez doucement le tube et centrifugez-le à 400 x g pendant 5 min à RT.
4. Diluer une solution BSA à 7,5 % 1:50 dans 100 ml de PBS (avec chlorure de calcium et de magnésium) jusqu’à une concentration finale de 0,15 % (p/v ; PBSA). Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 10 ml de PBSA. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à RT.
5. Réintroduire dans 1 ml de PBSA. Prélever une aliquote de 20 μl de suspension cellulaire et l’ajouter à 380 μl de PBSA (dilution 1:20). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un cellomètre. Diluer à la concentration requise (1 x 10⁶/ml pour les filtres Transwell et Ibidi microslide) dans PBSA. Maintenir la suspension des neutrophiles à la RT jusqu’au dosage.

4. Assemblage du système d’écoulement

1. Configurez le système d’écoulement comme illustré à la Figure 1C. Allumez le chauffage et réglez-le à 37 °C. Fixez une seringue de 20 ml (retirez le piston) et une seringue de 5 ml à un robinet à 3 voies. Fixez le robinet à la chambre en plexiglas à l’aide de ruban adhésif Micropore.
2. Mesurez et coupez un long morceau de tube en silicone de 2/4 mm (d’épaisseur) qui correspond à peu près à la distance entre la vanne et le robinet à 3 voies. Coupez un morceau de tube de 1/3 mm (mince) de 8 à 10 mm de long et insérez-le à une extrémité du tube épais. Fixez le côté du tube épais sur le robinet à 3 voies.
3. Connectez l’extrémité mince du tube à un orifice de la microvanne électronique à 3 voies. Il s’agit du « réservoir de lavage ». Coupez un morceau de tube épais et mince de 6 à 8 mm de long.
4. Insérez le tube mince dans une extrémité du tube épais. Fixez l’extrémité épaisse de la tubulure à une seringue de 2 ml (retirez le piston).
5. Connectez l’extrémité du tube mince de la seringue de 2 ml à un orifice de la microvanne électronique pour former le « réservoir d’échantillon ». Connectez la vanne à la chambre d’écoulement du filtre en mesurant et en coupant un long morceau de tube mince correspondant à la distance entre la microvanne et le centre de la platine du microscope.
6. Pour le modèle microslide, fixez un morceau de tube épais de 8 à 10 mm à l’extrémité du tube fin. Placez un connecteur en forme de L à l’extrémité du tube épais. Cela se connectera à la microlame. Pour le modèle à filtre, fixez un morceau de manomètre Portex Blue Line de 8 à 10 mm reliant le tube à l’extrémité du tube fin.
7. Placez l’extrémité mince du tube sur la microvanne. Il s’agit de la sortie commune pour les réservoirs de lavage et d’échantillonnage. Remplissez les réservoirs avec du PBSA. Amorcez les tubes en faisant passer du PBSA à travers eux pour éliminer les bulles d’air.
8. Fixez la tubulure du manomètre à une seringue en verre de 29 mm (50 ml). Amorcez la seringue en la remplissant de 10 ml de PBSA. Retournez la seringue de manière à ce que l’extrémité reliée au tube soit tournée vers le haut et expulsez toutes les bulles d’air. Recharge avec 5 ml de PBSA.
9. Pour le modèle à microlames uniquement, fixez un morceau de tube épais de 10 à 12 mm à l’extrémité du tube du manomètre menant à la seringue en verre. Placez un connecteur en forme de L à l’extrémité du tube épais. Placez la seringue en verre dans un pousse-seringue pour la perfusion/le retrait.
10. Calculez le débit de remplissage (Q) nécessaire pour générer la contrainte de cisaillement de paroi souhaitée (τ_w en Pascal, Pa) de 0,1 Pa (filtres Transwell) ou 0,05 Pa (microlames Ibidi) à l’aide des formules suivantes :
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Où w = largeur interne et h = profondeur interne du canal d’écoulement. n = viscosité de la solution qui s’écoule ; PBSA est n = 0,7 mPa.s. Pour la chambre d’écoulement du filtre à plaques parallèles, la largeur (w) est de 4 mm et la profondeur (h) est de 0,133 mm. La profondeur de la chambre peut varier légèrement en raison des différences d’épaisseur du joint Parafilm utilisé. Pour le microslide Ibidi, la largeur est de 3,8 mm et la profondeur est de 0,4 mm.
    note: En raison des différences dans les dimensions du canal d’écoulement et de la dynamique de capture, nous utilisons des contraintes de cisaillement différentes pour le modèle de microlames par rapport au modèle de filtre.

5. Mise en place de la chambre d’écoulement à plaques parallèles incorporant des filtres

1. Découpez un morceau de Parafilm (de la même taille que la lamelle en verre) à l’aide d’un gabarit métallique. Découper une fente de 20 x 4 mm dans le Parafilm (pour créer le canal d’écoulement) à l’aide d’un gabarit métallique. Utilisez le joint pour marquer le canal d’écoulement sur la lamelle en verre.
2. Alignez les bords du filtre à 6 puits sur la lamelle en verre. Assurez-vous que le filtre couvre les marquages du canal d’écoulement. Découpez soigneusement le filtre à l’aide d’un scalpel de type 10A.
3. Couvrez soigneusement le filtre avec un joint Parafilm, en vous assurant que la fente du canal d’écoulement se trouve au milieu du filtre (Figure 1D). Utilisez un morceau de mouchoir propre et repoussez les bulles.
4. Placez la lamelle dans l’évidement de la plaque inférieure de la chambre d’écoulement en plexiglas. Placez la plaque supérieure en plexiglas sur le dessus du joint et vissez les plaques ensemble (Figure 1D).
5. Tournez le robinet à 3 voies pour permettre au tampon de lavage (PBSA) de s’écouler à travers la vanne. Connectez le tube du manomètre à l’orifice d’entrée de la plaque supérieure en plexiglas. Faites passer PBSA dans le canal d’écoulement pour permettre aux bulles de passer.
6. Connectez le tube du manomètre de la pompe à seringue à l’orifice de sortie de la plaque en plexiglas. Réglez la pompe à seringue pour qu’elle se remplisse et appuyez sur exécuter. Nettoyez tout PBSA qui a coulé sur la plaque supérieure de la chambre.
7. Placez la chambre sur la platine d’un microscope à contraste de phase inversé. Ajustez la mise au point pour visualiser l’EC au-dessus des filtres (Figure 1B).

6. Perfusion de leucocytes sur les cellules endothéliales

1. Mettre 2 ml de neutrophiles purifiés dans le réservoir d’échantillon et laisser réchauffer pendant 2 min. Laver l’endothélium avec du PBSA pendant 2 min.
2. Allumez la valve pour perfuser les neutrophiles sur l’endothélium. Administrer le bolus de neutrophiles pendant 4 min. Fermez la vanne et perfuser PBSA du réservoir de lavage pour le reste de l’expérience.
3. S’assurer que les bulles d’air ne passent pas à travers le canal d’écoulement à aucun moment pendant l’essai, car cela perturberait la monocouche EC et provoquerait le détachement des neutrophiles adhérents.

7. Enregistrement de la capture et du comportement des neutrophiles

1. Enregistrer le recrutement des neutrophiles pendant l’écoulement des neutrophiles ou après la perfusion.
2. Effectuez tous les enregistrements numériques d’au moins 5 à 10 champs au centre du canal d’écoulement. Identifiez le centre du canal en déplaçant l’objectif vers le bord du canal au niveau de l’orifice d’entrée et en identifiant le milieu de l’orifice.
   1. Pour l’enregistrement pendant l’écoulement des neutrophiles, prenez des images d’un seul champ toutes les 10 secondes pendant 1 min. Déplacez-vous le long du canal et enregistrez un autre champ pendant 1 minute. Répétez l’opération pendant toute la durée du bolus.
   2. Pour l’enregistrement post-perfusion, effectuez des enregistrements de 10 secondes de 5 à 10 champs au centre du canal d’écoulement pour évaluer le comportement des leucocytes (généralement 2 minutes après la fin du bolus de neutrophiles). Prenez des images toutes les secondes dans l’intervalle de 10 secondes. Cela laisse suffisamment de temps pour la capture à partir de l’écoulement et l’analyse du comportement des neutrophiles adhérents.
   3. Enregistrez une seule trame contenant au moins 10 neutrophiles transmigrés pendant 5 min, en prenant des images toutes les 30 secondes. Cela peut être utilisé pour calculer la vitesse des cellules migrées (au-dessus ou en dessous de l’endothélium).
   4. Enregistrez une autre série de champs de 10 secondes (généralement 9 minutes après la perfusion). Cela laisse aux neutrophiles le temps de migrer à travers la monocouche endothéliale.
   5. Arrêtez le pousse-seringue et retirez la tubulure. Démontez la chambre d’écoulement et rincez le réservoir d’échantillon et la tubulure. Répétez l’opération pour les filtres/canaux de microlames suivants.

8. Analyse du recrutement et du comportement des leucocytes

1. Comptez le nombre de neutrophiles dans chaque champ pendant les enregistrements de 10 secondes au point de temps de 2 minutes. Toutes les cellules doivent être présentes dans le champ premier-deuxième pour être comptées. Les cellules qui se trouvent partiellement dans le champ sur les 2 côtés (par exemple, en haut/à droite) du champ de vision sont incluses dans le décompte, à condition qu’elles restent dans le champ pendant les 10 secondes complètes.
2. Calculer le nombre moyen de neutrophiles adhérents par champ. Mesurez la longueur et la largeur du champ enregistré. Calculez la superficie du champ. Calculez le nombre de champs dans 1 mm². Multipliez le nombre moyen de neutrophiles par le nombre de champs dans 1 mm².
3. Calculez le nombre total de neutrophiles perfusés en multipliant la quantité de neutrophiles perfusés (p. ex., 2 x 10⁶/ml*Q [p. ex., 0,0999 ml/min pour une chambre d’écoulement sur plaques parallèle]) par la durée du bolus (p. ex., 4 min).
4. Divisez le nombre de neutrophiles/mm² par le nombre total de neutrophiles perfusés pour déterminer le nombre total de cellules qui ont adhéré (cellules adhérentes/mm² / 10⁶ perfusées).
5. Évaluez si les neutrophiles adhérents sont roulants, fermement adhérents ou transmigrés.
   1. Un neutrophile roulant est en phase brillante et se déplace lentement le long de la monocouche endothéliale (1 à 10 μm/sec).
   2. Les cellules fermement adhérentes sont brillantes en phase et liées à la surface EC, soit en restant stationnaires (c’est-à-dire qu’elles ne bougent pas pendant l’enregistrement), soit en ayant subi un changement de forme et en migrant sur la surface EC (Figure 1Ei).
   3. Un neutrophile transmigré est en phase sombre et sous la couche EC (Figure 1Eii).
6. Calculez le pourcentage de cellules adhérentes qui sont mobiles, stationnaires et transmigrées. Alternativement, le comportement des neutrophiles peut être exprimé en nombre total de cellules qui présentent les différents comportements en appliquant la même formule que celle utilisée pour calculer l’adhésion totale (comme décrit aux étapes 8.6 et 8.7).
   1. Marquez le bord d’attaque d’un neutrophile roulant. Marquez le bord d’attaque de la même cellule à la fin de la séquence de 10 secondes. Tracez une ligne entre les 2 points et mesurez la distance parcourue par la cellule.
   2. Divisez cette valeur par la durée de l’enregistrement dans lequel la cellule défile (c’est-à-dire 10 secondes). Essayez de sélectionner des neutrophiles qui sont sur le terrain pendant tout l’intervalle de 10 secondes.
7. Pour calculer la vitesse des neutrophiles migrant au-dessus de la surface (en forme de phase brillante modifiée) ou sous l’endothélium (phase sombre), utilisez l’enregistrement de 5 minutes.
   1. Dessinez un contour des cellules migrées au début de la séquence et suivez leurs mouvements tout au long de la séquence. Notez les positions X et Y du centroïde à chaque intervalle de 1 minute pour chaque cellule. Soustrayez les valeurs des positions X et Y de la première image de la séquence des valeurs de la deuxième image. Ceci est basé sur le théorème de Pythagore.
   2. Soustrayez les valeurs de la deuxième image de la troisième image. Procédez ainsi pour toutes les images de la séquence. Mettez les valeurs X et Y au carré et additionnez-les.
   3. Racine carrée : valeur résultante. Calculez le vecteur vitesse de chaque cellule en faisant la moyenne des vélocités calculées à chaque intervalle de minutes. Suivez 10 neutrophiles migrés et calculez la vitesse moyenne.

Résultats

Graphique 1. Etablissement de la co-culture EC-MSC et analyse du recrutement des neutrophiles à l’aide d’un test d’adhésion basé sur le flux. (A) Micrographie de (i) la CEM primaire et (ii) le passage 3 BMMSC cultivés sur des flacons de culture tissulaire. (B) Micrographie de la CE-CSM cultivée sur des inserts filtrants Transwell à 6 puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase de type Ia	sigma	Réf. C2674	Diluer dans 10ml de PBS pour obtenir une concentration finale de 10mg/ml. Conserver à -20°C dans des aliquotes de 1ml.
Le PBS de Dulbecco	sigma	D8662	Avec du chlorure de calcium et de magnésium. Conserver stérile et conserver à température ambiante.
1x moyen M199	Gibco	Référence 31150-022	Réchauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation.
Sulfate de gentamicine	sigma	G1397	A conserver à 4°C. Ajouter au flacon M199 de 500ml.
Facteur de croissance épidermique humain	sigma	E9644	Conserver à -20°C dans des aliquotes de 10μl.
Sérum de veau fœtal (SCF)	sigma	F9665	Le FCS doit être testé par lots pour assurer la croissance et la viabilité de la CE isolée. Inactivation thermique à 56°C. Conserver dans des aliquotes de 10ml à -20°C.
Amphotéricine B	Gibco	Référence 15290-026	Puissant et devient toxique en une semaine, de sorte que le milieu HUVEC complet et frais doit être préparé chaque semaine. Conserver à -20°C dans des aliquotes de 1 ml.
Hydrocortisone	sigma	N° H0135	Le stock est dans l’éthanol. Conserver à -20°C dans des aliquotes de 10μl.
Collagénase de type II	sigma	Réf. C6885	Diluer la pâte dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 100 mg/ml. Conserver à -20°C dans des aliquotes de 100μl.
Hyaluronidase	sigma	N° H3631	Diluer la pâte dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 20 000 U/ml. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 100 μl.
Passoire à cellules de 100 μm pour tube de centifuge de 50 ml	Fournitures de laboratoire scientifique (SLS)	Référence 352360	D’autres crépines cellulaires disponibles dans le commerce (par exemple Greiner bio-one) peuvent également être utilisées.
DMEM faible teneur en glucose	Biosérums	LM-D1102/500	Réchauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation.
Mélange pénicilline/streptomycine	sigma	Réf. P4333	Conserver à -20°C dans des aliquotes de 1 ml.
Fiole de culture tissulaire de 25cm2	Sls	353109
Fiole de culture tissulaire de 75cm2	Sls	353136
Flacon de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse	Lonza	PT-2501	Stocker dans de l’azote liquide à l’arrivée. Les cellules se trouvent au passage 2 à l’arrivée mais sont désignées passage 0. Exapand au passage 3 et stockage dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.
Milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Réchauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation. Pour la coloration Cell Tracker Green, utilisez un milieu sans FCS.
Solution EDTA (0,02 %)	sigma	E8008	Conserver à 4°C. Réchauffer au bain-marie à 37°C avant utilisation.
Solution de trypsine	sigma	Réf. T4424	Conserver à -20°C dans des aliquotes de 2 ml. Décongeler à température ambiante et utiliser immédiatement.
Cryoflacons	Greiner bio-one	2019-02	Garder sur de la glace avant d’ajouter avant d’ajouter la suspension cellulaire.
Conteneur de congélation Mr. Frosty	Nalgene	Référence 5100-0001	Conserver à température ambiante. Lors de l’ajout de cryoflacons, les cellules sont stockées à -80 °C pendant 24 heures avant de transfusionner les cellules en azote liquide.
Colorant vert pour traqueur de cellules	Technologies du vivant	Réf. C2925	Conserver dans des aliquotes de 5 μl à -20 °C. Diluer dans 5 ml de MSCGM préchauffé (à 37 °C).
Chambres de comptage cellulaire	Nexcelom	SD-100	Alternativement, un hémocytomètre peut être utilisé.
Cellomètre compteur automatique de cellules T4	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Facteur de nécrose tumorale α (TNFα)	Systèmes de R&D	210-TA-100	Diluer la pâte dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 100 000 U/ml. Conserver à -80 °C dans des aliquotes de 10 μl.
Filtres PET Transwell à 6 puits, 0,4 μm	Sls	Référence 353090
K2-EDTA en tubes de 10ml	Sarstedt		Conserver à température ambiante.
Histopaque 1119	sigma	Référence 11191	Conserver à 4°C. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
Histopaque 1077	sigma	Référence 10771	Conserver à 4°C. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
Tube à fond rond de 10 ml	Bois d’Appleton	SC211 142 COMME
Solution BSA Fraction V à 7,5 %	Technologies du vivant	Référence 15260-037	Conserver à 4°C.
Seringues Plastipak de 20 ml	Faucon BD	300613
Seringues Plastipak 5ml	Faucon BD	302187
Seringues Plastipak de 2 ml	Faucon BD	300185
Ruban chirurgical hypoallergénique 3M 9m x 2.5cm	Micropores	N° 1530-1	Utilisez-le pour fixer le robinet de seringue sur la paroi de la chambre en plexiglas.
Tube en caoutchouc de silicone, diamètre intérieur/diamètre extérieur (ID/OD) de 1/3 mm (tube fin)	Fisher Scientific	FB68854	Coupez le tube en silicone à la taille appropriée. Tous les tubes menant directement à la microvanne électronique doivent être minces.
Tube en caoutchouc de silicone ID/OD de 2/4mm (tube épais)	Fisher Scientific	FB68855
Tube de manomètre Portex Blue Line	Smiths	Référence 200/495/200	Tubulure menant à la pompe à seringue.
Robinet d’arrêt à 3 voies	BOC Ohmeda (Alberta
Seringue en verre de 50 ml pour pompe	Popper Micromate	550962	Doit être amorcé avant utilisation en éliminant toutes les bulles d’air.
Lamelle en verre	Raymond A Lamb		Lamelles de recouvrement de 26x76mm fabriquées sur commande. Numéro de lot 2440980.
Joint Parafilm	American National Can Company		Découpez un morceau de parafilm de 26x76 mm à l’aide d’un gabarit en aluminium et découpez-y une fente de 20x4 mm à l’aide d’un scalpel 10a. L’épaisseur du joint est d’environ 133 μm.
Deux plaques parallèles en plexiglas	Laboratoire de technologie appliquée Wolfson		Chambre spécialement conçue composée de plaques parallèles maintenues ensemble par 8 vis. La plaque inférieure est dotée d’une fente d’observation découpée au milieu et d’un évidement peu profond fraisé pour laisser de l’espace pour la lamelle, le filtre et le joint. La plaque supérieure en plexiglas a un trou d’entrée et de sortie positionné sur le canal d’écoulement.
Microvanne électronique à 3 voies avec espace mort min.	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Connecté électroniquement à une alimentation 12 volts CC.
Pousse-seringue pour perfusion/prélèvement (PHD2000)	Appareil de Harvard	70-2001	Réglez le diamètre sur 29 mm et le taux de remplissage (débit).
Connecteur en forme de L	Labhut	LE876	À fixer aux orifices d’entrée et de sortie sur le canal de microglissière Ibidi.
Caméra vidéo	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connecté à un ordinateur qui permet d’enregistrer des vidéos digitall.
Image-Pro Plus 7.0	Cybernétique des médias	Référence 41N70000-61592	Pour l’analyse des données. Marquez manuellement les cellules affichant les différents comportements. Cellules de suivi pour l’analyse des vitesses de roulement et de migration.

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