1. Induction de la sénescence par les médicaments de chimiothérapie dans des cellules cancéreuses en culture
REMARQUE : Toutes les étapes de manipulation cellulaire de cette section doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité en utilisant des pratiques stériles. Cette section est écrite pour les types de cellules adhérentes. Les cellules de suspension peuvent être utilisées avec les modifications appropriées, comme indiqué.
- Cultivez des lignées cellulaires cancéreuses selon le protocole standard du fournisseur ou du laboratoire qui a fourni la ou les lignées cellulaires spécifiques utilisées.
note: Les cellules à faible passage (p < 10) sont généralement préférées car les niveaux de sénescence réplicative sont plus faibles, c’est-à-dire le bruit de fond plus faible, dans les échantillons de cellules non traités.
- Un jour avant l’induction de la sénescence par les médicaments, prélever des cellules avec de la trypsine-EDTA à 0,25 % (ou selon les recommandations). Neutralisez la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu de culture complet et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique stérile.
note: Cette étape n’est pas nécessaire pour les cellules de suspension.
- Comptez les cellules à l’aide de la méthode standard de l’hémacytomètre et enregistrez les cellules/ml. Cellules sur plaque à 1 × 103-10 × 103 cellules/cm2 dans des boîtes de culture en plastique standard à 6 puits.
note: La densité optimale du placage dépend du taux de prolifération des cellules et doit être déterminée par l’utilisateur. Les cellules doivent être en phase de croissance logarithmique à une confluence d’environ 10 % à 20 % au moment du traitement (c.-à-d. après une incubation de 18 à 24 heures après l’ensemencement). La densité de départ (cellules/mL) des cellules de suspension doit être déterminée par l’utilisateur. Les plaques à six puits produisent généralement suffisamment de cellules sénescentes par puits pour un échantillon d’analyse de cytométrie en flux standard. Dans le cas d’un tri par flux, une surface beaucoup plus grande (p. ex., plusieurs plaques P150) devrait être utilisée pour permettre la récupération d’un nombre suffisant de cellules sénescentes pour les essais en aval (≥1 × 106).
- Incuber les cellules en boîte pendant la nuit (18-24 h) dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et une casserole humide.
- Traitez les cellules en plaques avec un ou plusieurs médicaments de chimiothérapie induisant la sénescence. Incluez au moins un témoin positif, par exemple l’étoposide (ETO) ou la bléomycine (BLM). Préparez des puits en double par médicament. Inclure un ensemble traité avec le véhicule uniquement comme contrôle.
note: Une courbe de dose pour chaque agent expérimental doit être testée par l’utilisateur afin de déterminer la concentration optimale pour l’induction de la sénescence dans la ou les lignées cellulaires utilisées.
- Incuber les cellules pendant 4 jours dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et un bac d’humidité pour permettre le début de la sénescence. Examinez quotidiennement les changements morphologiques attendus à l’aide d’un microscope optique.
note: Des temps d’incubation de 3 à 5 jours peuvent être acceptables selon le taux d’apparition de la sénescence. Le milieu peut être changé et l’agent réappliqué (ou non), selon le souhait, pour favoriser des conditions de croissance saines tout en atteignant un pourcentage acceptable de cellules sénescentes.
- Après le début de la sénescence, récoltez les cellules en ajoutant de la trypsine-EDTA 0,25 % pendant 5 min à 37 °C. Lorsque les cellules sont dissociées en suspension, neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu complet.
note: Cette étape n’est pas nécessaire pour les cellules qui se développent en suspension. Si une coloration de marqueur de surface doit être effectuée, évitez d’utiliser la trypsine-EDTA car elle peut détruire temporairement les antigènes de surface sur les cellules. Au lieu de cela, dissociez doucement la monocouche à l’aide d’un grattoir à cellules en plastique stérile (ou d’un réactif de dissociation alternatif conçu pour préserver les antigènes de surface).
- Comptez les cellules de chaque échantillon à l’aide d’un hémacytomètre. Calculez le nombre de cellules/ml pour chaque échantillon.
note: Le bleu trypan peut être ajouté pour évaluer le pourcentage de cellules mortes à ce stade (c’est-à-dire en raison d’un traitement médicamenteux), mais la mort cellulaire sera également déterminée avec un colorant de viabilité fluorescente pendant le processus de coloration DDAOG.
- Aliquote ≥0,5 × 106 cellules par échantillon dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL.
note: Le nombre de cellules par échantillon doit être normalisé pour tous les échantillons.
- Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 × g dans une microcentrifugeuse à 4 °C. Retirer le surnageant.
note: S’il n’existe pas de microcentrifugeuse réfrigérée, il peut être acceptable d’effectuer des centrifugations à température ambiante pour certains types de cellules résilientes.
- Passer à la coloration DDAOG dans la section 2.
2. Coloration DDAOG de SA-β-Gal dans des échantillons cellulaires
- Diluer 1 mM de stock de bafilomycine A1 à 1:1 000x dans un milieu DMEM (sans FBS) pour une concentration finale de 1 μM.
- Ajouter la solution préparée de Baf-DMEM aux échantillons de pastilles cellulaires (à partir de l’étape 1.11) pour une concentration de 1 × 106 cellules/mL.
note: Par exemple, si vous utilisez 0,5 × 106 cellules par échantillon, ajoutez 0,5 mL de Baf-DMEM.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C (sans CO2) sur un rotateur/agitateur réglé à vitesse lente.
note: Évitez les incubateurs de CO2 pour le processus de coloration, qui peuvent acidifier les solutions et ainsi interférer avec la coloration Baf et DDAOG.
- Sans lavage, ajouter la solution mère de DDAOG (5 mg/mL) à 1:500x (10 μg/mL final) à chaque échantillon. Pipette pour mélanger. Replacer sur un rotateur/agitateur à 37 °C (sans CO2) pendant 60 min. Protéger de la lumière directe.
- Centrifugez les tubes pendant 5 min à 1 000 x g à 4 °C. Retirez le surnageant.
- Laver avec 1 ml de BSA 0,5 % glacé par tube et pipeter pour mélanger. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 x g à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez cette étape 2 fois pour bien laver les cellules. Retirez le surnageant et continuez.
note: Il est important d’effectuer les étapes de lavage de l’étape 2.6 pour éliminer le DDAOG non désiré, qui peut présenter une émission de fluorescence indésirable (460/610 nm).
- (Facultatif) Fixation et stockage des cellules colorées au DDAOG pour une analyse ultérieure
- Ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde glacé à 4 % goutte à goutte à chaque échantillon lavé. Pipette pour mélanger.
- Incuber 10 min à température ambiante.
- Lavez les cellules 2 fois avec 1 mL de PBS.
- Conservez les échantillons jusqu’à 1 semaine à 4 °C avant l’analyse par cytométrie en flux.
note: Pour les échantillons fixes, sautez l’étape 2.8.
- Diluer le stock de Calcein Violet 450 AM (1 mM) à 1:1 000x dans 1 % de BSA-PBS (1 μM final). Ajoutez 300 μL (pour les échantillons de cellules cultivées) aux pastilles de cellules lavées à partir de l’étape 2.6. Incuber pendant 15 min sur glace dans l’obscurité.
- Passez à la configuration de la cytométrie en flux (section 3).
3. Configuration du cytomètre en flux et acquisition des données
- Transférez les échantillons de cellules dans des tubes compatibles avec l’instrument de cytométrie en flux. Placez les tubes sur de la glace et gardez-les à l’abri de la lumière.
note: Si des agrégats sont observés dans les suspensions cellulaires, faire passer la suspension dans des crépines cellulaires de 70 à 100 μm avant l’analyse. N’utilisez pas de crépines de 40 μm car elles peuvent exclure certaines des plus grandes cellules sénescentes.
- Dans le logiciel référencé (voir la table des matériaux), ouvrez les graphiques suivants : 1) diagramme de points FSC-A vs SSC-A, 2) histogramme du canal violet, 3) canal rouge lointain (par exemple, APC-A) en fonction du canal vert (par exemple, FITC-A) dot plot.
note: Des tracés d’exclusion doublets et des histogrammes monocanaux peuvent également être utilisés, mais ne sont pas strictement obligatoires.
- Lancer l’acquisition des données du cytomètre.
- Placez l’échantillon de contrôle du véhicule uniquement taché de DDAOG sur l’orifice d’admission. À faible vitesse d’alimentation, commencez à acquérir des données d’échantillon.
- Ajustez les tensions FSC et SSC de sorte que >90 % des événements soient contenus dans le graphique. Si les cellules ne s’adaptent pas bien au graphique, réduisez le paramètre de mise à l’échelle de la zone à 0,33-0,5 unité.
- Retirez l’échantillon destiné uniquement au véhicule sans enregistrer les données.
- (Facultatif) Ajoutez une gouttelette de microsphères d’étalonnage arc-en-ciel dans un tube cytométrique contenant 1 mL de PBS. Placez le tube sur l’orifice d’admission du cytomètre. Commencez à acquérir des exemples de données.
- Ajustez les tensions des canaux violet, vert et rouge lointain de sorte que le pic supérieur de la microsphère arc-en-ciel soit dans la plage de 104 à 105 unités de fluorescence relative dans chaque canal et que tous les pics soient bien séparés dans chaque canal. Enregistrez 10 000 événements. Retirez le tube.
- Placez l’échantillon de contrôle positif (p. ex., BLM, ETO) coloré au DDAOG sur l’orifice d’admission. À basse vitesse, acquérez des données d’échantillon. Observez les événements dans les canaux FSC, SSC, violet, vert et rouge lointain pour s’assurer que plus de 90 % des événements sont contenus dans toutes les placettes. Recherchez une augmentation du signal AF et DDAOG par rapport au contrôle uniquement du véhicule.
- Si vous utilisez un cytomètre de tri, lancez le tri à cette étape.
- Aux fins de la tenue des registres, consignez 10 000 cellules pour l’échantillon de contrôle et chaque échantillon trié.
- Triez la quantité souhaitée de cellules (≥1 × 106 convient généralement) dans un tube de prélèvement adapté à l’instrument avec 3 à 5 ml de milieu de culture.
- Après le tri, passez à la culture ou à l’analyse en aval.
note: Pour le cytomètre en flux calibré utilisé ici, les tensions optimales des canaux se situent généralement entre 250 et 600 (milieu de gamme), mais les tensions optimales et les plages de tension des canaux varient d’un instrument à l’autre. Évitez d’utiliser des tensions à des plages très basses ou élevées, qui peuvent supprimer le signal ou amplifier le bruit.
- Après avoir terminé les étapes 3.1 à 3.5 et ajusté les paramètres du cytomètre au besoin, consignez les données de tous les échantillons. Assurez-vous que les paramètres restent uniformes pour tous les enregistrements d’échantillons. Enregistrez ≥10 000 événements par échantillon de cellule cultivée.
note: Bien que le contrôle et l’analyse puissent être effectués à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données (par exemple, FACSDiva), un flux de travail complet de contrôle et d’analyse à effectuer après l’acquisition à l’aide d’un logiciel d’analyse distinct (FlowJo) est décrit à la section 4 ci-dessous. L’analyse post-acquisition est privilégiée pour réduire le temps passé au poste de travail du cytomètre et profiter des outils supplémentaires inclus dans le logiciel d’analyse dédié.
- Enregistrez des exemples de données au format de fichier .fcs. Exportez les fichiers vers un poste de travail équipé d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux (par exemple, FlowJo).
4. Analyse des données de cytométrie en flux
REMARQUE : Le flux de travail présenté utilise le logiciel FlowJo. Un autre logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux peut être utilisé si les étapes clés décrites dans cette section sont suivies de la même manière.
- À l’aide du logiciel FlowJo, ouvrez les fichiers de données .fcs à partir de l’étape 3.7.
- Ouvrez la fenêtre de mise en page.
- Faites glisser et déposez tous les échantillons dans la fenêtre de mise en page.
- Cellules viables de porte.
- Double-cliquez d’abord sur les données d’exemple pour la commande de véhicule uniquement pour ouvrir sa fenêtre de données.
- Visualisez les données sous la forme d’un histogramme de canal violet. Identifiez les cellules viables colorées par CV450 en fonction de leur fluorescence plus brillante que les cellules mortes.
- Dessinez une porte à l’aide de l’outil d’histogramme à porte unique pour inclure uniquement les cellules viables. Nommez la porte viable.
- Ensuite, à partir de la fenêtre de disposition de l’échantillon, faites glisser la porte viable sur les autres échantillons de cellule pour appliquer la porte uniformément.
- Dans la fenêtre de mise en page, visualisez tous les échantillons sous forme d’histogrammes de canal violet (viabilité). Vérifier que la détection de cellules viables est appropriée pour tous les échantillons avant de continuer ; Si ce n’est pas le cas, faites les ajustements nécessaires.
note: La coloration de viabilité peut présenter des variations d’un traitement à l’autre.
- Cellules sénescentes de porte.
- Double-cliquez sur les données de la cellule viable fermée pour que la commande du véhicule uniquement ouvre sa fenêtre de données.
- Visualisez les données sous la forme d’un graphique à points pour le canal rouge lointain (DDAOG) et le canal vert (AF).
- Dessinez une porte à l’aide de l’outil de contrôle rectangulaire pour inclure <5 % des cellules DDAOG+ et AF+ (quadrant supérieur droit). Nommez la porte sénescente.
- Ensuite, à partir de la fenêtre de disposition de l’échantillon, faites glisser la porte sénescente sur les sous-ensembles viables des autres échantillons de cellule pour appliquer la porte uniformément.
- Dans la fenêtre de mise en page, faites glisser et déposez tous les sous-ensembles de cellules viables contrôlés dans la section 4.4. Visualisez tous les échantillons viables sous forme de diagrammes à points rouge lointain (par exemple, APC-A) par rapport au canal vert (par exemple, FITC-A).
- S’assurer que la porte sénescente dessinée à l’étape 4.5.3 est visible sur tous les tracés et que la porte pour la commande du véhicule seulement présente des cellules sénescentes ≤5 % à 10 %.
- Une fois que le pourcentage de cellules sénescentes a été déterminé à l’aide des étapes ci-dessus, présentez les données résultantes à l’aide des graphiques FlowJo, résumées dans un tableau de données et/ou analysées statistiquement à l’aide d’un logiciel standard.
